微生物细胞的一般固定方法

一、微生物细胞的一般固定方法

固定化活细胞的制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种。

1．物理吸附法

带电的微生物细胞和载体之间的静电相互作用，使细胞体吸附固定在硅藻土、木材、玻璃、陶瓷和塑料等载体上。如酵母细胞是带负电的，在固定时要选择带正电的载体。在pH为4时，热带假丝酵母、酿酒酵母等在陶瓷表面上的吸附程度较大，载体表面的40%～70%被细胞牢固吸附，不会被高流培养液冲掉。载体的性质也影响细胞与载体之间的相互作用，主要是载体的成分、表面电荷、表面积和pH的影响。所有的玻璃和陶瓷都是由不同比例的氧化硅、氧化镁等组成的，如将玻璃等放在溶液中，在它的表面会发生离子交换，形成不再是铝、硅等的氧化物，而为相应的氢氧化物。载体表面的羟基可被微生物细胞表面的氨基或羧基所取代，在细胞与载体之间形成键。物理吸附法固定化活细胞的酶活性不受影响，但吸附过程相当复杂，吸附过程与微生物的性质、载体的特性及细胞与载体之间发生的相互作用有关，只有这些参数配合恰当时才能形成稳定的微生物细胞——载体复合物。

物理吸附法固定微生物细胞现已广泛用于废水处理工程——生物膜法，中国科学院微生物研究所应用自养菌和异养菌的混合菌，吸附于玻璃钢蜂窝填料繁殖成生物膜，用以处理含硫氰酸钠的腈纶废水。北京工业大学应用驯化的混合菌吸附于活性炭的大孔及其表面，用以处理印染废水等。

2．包埋法

将微生物细胞用物理的方法包埋在琼脂、海藻酸钠、明胶、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇（PVA）等凝胶载体内，使微生物细胞固定化。一般的包埋成形法比较复杂，机械性能差、易磨损，不适于大批量生产。因而近年来一些学者又研究了一种制备珠型固定化细胞技术。

（1）琼脂凝胶包埋法。称取4g琼脂或琼脂糖溶于50ml 0．2MpH为7．0的磷酸缓冲液中，加热溶解后，冷却到55℃左右，将细胞浓度为60%左右的细菌悬浮液于40℃下保温，然后与琼脂溶液混合均匀。用注射器针头将热的混合液滴入冷的甲苯溶液、四氯乙烯溶液或液体石蜡内，冷却形成2～3mm直径的小球。或将热琼脂－细菌混合液流加到搅拌下的500ml 30℃的醋酸丁酯中，加完后继续搅拌3分钟，到混合物分散成小滴，迅速加入300ml冷的醋酸丁酯，再搅拌2～5分钟，倾去醋酸丁酯，抽滤干，用缓冲液洗至无醋酸丁酯味，即制成珠型固定化细胞，小珠1～3mm。使用前将球形固定化细胞放入消毒好的营养液中30℃下活化24小时后再用。

（2）海藻酸钙凝胶包埋法。称取2g海藻酸钠，加30ml生理盐水于高压灭菌锅中加热溶解、冷却到40℃，取20ml与20ml细胞浓度为50%的细菌悬浮混合均匀，然后用注射器针头滴加到0．1M氯化钙或4%的氯化钡溶液中，边滴边摇，使其形成2mm直径球型小珠，然后用生理盐水洗涤。或将混合液流加到搅拌下的200～500ml醋酸丁酯中，当分散成小滴后，迅速加入5ml 0．1M的氯化钙溶液，继续搅拌5～10分钟，自然沉降，倾去醋酸丁脂，再加入50ml 0．1M的氯化钙溶液，浸泡1小时，进一步固化，然后用蒸馏水彻底洗涤，即得直径为1～3mm的珠型固定化细胞。干后可保存于低温下，使用前需放入消毒好的营养液中30℃下活化24小时后再用。由于磷酸盐会破坏凝胶的结构，因而在使用海藻酸钠固定细胞时尽量防止磷酸盐的加入。

（3）明胶包埋法。称取6g明胶，加入50ml 0．1MpH为7．0的磷酸缓冲液，加热溶解后冷却至40℃，取20ml与20ml细胞浓度为60%的细菌悬液在40℃混合均匀，冷却凝固后切成1～2mm³方块，然后再加2．5%戊二醛，使包埋块悬浮在戊二醛溶液中，室温下轻轻搅拌4小时进行交联，滤去戊醛后，逐次用0．1M氯化钠和去离子水洗涤后即成。或者将明胶－菌体混合液流加到200ml 20℃搅拌下的醋酸丁酯溶液中，当分散成小珠后，迅速加入5ml 5%的戊二醛溶液，继续搅拌5～10分钟，倾去醋酸丁酯，水洗即得到珠型固定化细胞，再放入50ml的pH为5．0的戊二醛溶液中浸泡30分钟，然后彻底洗涤，即获得直径1～3mm的球形小珠。使用前将其放入营养液中30℃下活化24小时后再用。用戊二醛交联的明胶包埋法，可获得机械强度及工作稳定性较好的固定化细胞。

（4）聚丙烯酰胺凝胶包埋法。此法是较常用的一种包埋法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合形成三维网状结构的凝胶。常用的催化剂和加速剂是过硫酸铵和四甲乙二胺或三乙醇胺。

称取17．6g丙烯酰胺和1．2g N－N′－甲叉双丙烯酰胺溶于0．05MpH为7．0的Tris－HCl缓冲液中，取20ml与5g的湿菌泥混合均匀，加入50ml的40%过硫酸铵，混合均匀后流加到搅拌的豆油或液体石蜡中，搅拌分散成小滴，迅速加入250ml的四甲基乙二胺，小滴即很快聚合形成小珠，倾去流体，用水或缓冲液充分洗涤即可获得珠型固定化细胞。或将菌泥混合液加入1%过硫酸铵0．25ml和10%三乙醇胺4ml，将上述混合液搅拌均匀，不要出现气泡，置于40℃恒温浴中30分钟左右，即形成聚丙烯酰胺凝胶固定化细胞，在凝胶未干时切成2～3mm³小块，于50～60℃中干燥后保存。使用前将包埋好的固定化细胞放入消毒后的营养液中活化24小时再用。