薯蓣皂甙元提取的研究进展

薯蓣皂甙元提取的研究进展

谭之磊　乔长晟　许春英　贾士儒

（天津科技大学生物工程学院天津工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：盾叶薯蓣是我国特有的甾体激素类药源植物，也是世界上薯蓣皂甙元含量最高的资源植物，广泛分布于北亚热带及中亚热带地区。本文介绍了薯蓣皂甙元提取方面的研究进展，包括酸水解法、自然发酵法、酶水解法、超临界流体萃取法等。

关键词：薯蓣皂甙元；提取

薯蓣皂甙元（diosgenin）工业上称为薯蓣皂素，是合成多种甾体激素和甾体避孕药比较理想的前体，世界各国生产的甾体激素60%以上以它为原料，甾体激素药物应用广泛，常用于治疗风湿性关节炎、心脑血管疾病，在抗肿瘤、避孕、止血、消炎抗菌和杀虫等方面也占有重要的位置，在农业生产和畜牧业中也有广泛的应用，如养蚕、调节植物生长、调节家畜的发情、分娩和诱导泌乳等。甾体激素药物业的发展十分迅速，美国仅皮质激素一类就有60多种药品上市。甾体避孕药对我国计划生育的基本国策的执行有着重要作用。从1958年开始，我国也建立了以薯蓣皂甙元为主要原料的甾体激素药物工业，目前国内有众多厂家生产甾体激素类药物和甾体口服避孕药，是药品生产中仅次于抗菌素的一个重要领域^[1]。

薯蓣皂甙和甙元是植物体内所存在的甙类化合物中的一种。在植物界中以蔷薇科、石竹科、薯蓣科和无患子科等含量较多，其中尤以薯蓣科（Dioscorea）含量最多^[2]。薯蓣科有9属，约650种，除薯蓣属外其余属多为单种属或少种属。薯蓣属种类最为丰富，约600种，广布于热带地区，亦有少数种类分布于亚热带和温带地区，其中含有薯蓣皂甙元的植物有136种，而薯蓣皂甙元含量在1%以上的有41种^[3]。我国含有薯蓣皂甙元的薯蓣属植物有17种，其中薯蓣皂甙元含量在1%以上的有12种，可供工业生产利用的近10种。盾叶薯蓣（Dioscorea zingiberensis）又称黄姜是我国特有种，也是世界上薯蓣皂甙元含量最高的种^[4]。

根据我国薯蓣植物资源调查资料，盾叶薯蓣的自然分布区为北亚热带及中亚热带地区，主要分布于秦岭以南，向东延伸到中条山以南、南岭以北的米仓山、大巴山、武当山、武陵山、雪峰山、衡山等山区，以及长江中游及其支流嘉陵江、汉水、澧水、沅江、资水等流域的低中山丘陵，其东界为湘江流域以西，洞庭湖大平原，西界为四川盆地和云贵高原；垂直分布一般在海拔100～1500m。常生于江水河谷两岸的丘陵、低山、中山山坡、石灰岩的稀疏灌丛中、混交疏林及杂灌丛内或森林、沟谷边缘的路旁等。大量研究表明：野生状态下的盾叶薯蓣皂甙元含量与主要环境因素的关系密切^[5～7]。由于盾叶薯蓣分布范围较广，不同地区、居群的植株形态性状发生了变异，植物体内的皂素含量亦随环境条件的变化而高低各异。生态环境对盾叶薯蓣种内基因型变异影响较大，且在形态性状与活性成分积累等方面影响显著。因此，为了提高盾叶薯蓣开发效益，需进一步研究生态环境对薯蓣皂甙元形成影响的机理。

选育高薯蓣皂甙元含量的新品种是解决原料供应和保护有限野生资源的首选课题。我国从20世纪60年代就开始进行盾叶薯蓣的优良品种选育工作。1965年丁志遵^[6]最早进行了高含量盾叶薯蓣的单株筛选工作。先后采集了野生盾叶薯蓣单株1000多株，经过多次筛选得到薯蓣皂素含量为9.92%的“65033号”单株； 1966年筛选出皂素含量为13.97%的“6608号”单株； 1967年筛选出皂素含量高达16.15%的“670117号”单株；在1977年和1978年的筛选过程中又分别获得11.6% “77094号”和11.28% “780184号”的高皂素含量单株，表明我国特有的盾叶薯蓣不仅是我国而且也是当时世界上薯蓣属植物中皂素含量最高的种类。李军超等认为，盾叶薯蓣的生态型为基因与生态环境共同作用的结果，各生态型具有显著的形态特征，并与皂素含量关系密切，可作为判定皂素含量的依据。选育出的“安姜1号” 、“安姜2号” 、“安姜3号” 3个优良株系具有形态特征稳定，皂素含量高（均达到4%以上） ，抗性强等特点，通过了陕西省2002年林木良种审定^[7]。

利用植物组织培养技术繁殖薯蓣植物，既可保存种质资源又能快速繁殖优良品种，不但可解决种源问题，而且能有效防止种质退化。四川生物研究所一室体细胞研究组对盾叶薯蓣不同部位的愈伤组织诱导频率进行了研究，结果表明若以幼茎、幼叶为材料其诱导频率一般都比较高，分别为57.97%、83.14%；以块（根）茎为材料则诱导频率较低，只有1.78%^[8]。

盾叶薯蓣的根状茎含1.1%～16.15%的薯蓣皂甙元、45%～50%的淀粉、40%～50%的纤维素以及一些水溶性甙类、生物碱类、黄酮甙类、强心甙类、生物碱、单宁、色素等化学成分^[9]。薯蓣皂甙包括糖和甙元两部分，为了对皂甙进行定位，郭永兵等^[10]将盾叶薯蓣根茎分为5个区段，对其薯蓣皂甙元的分布进行研究，发现嫩茎顶端的薯蓣皂甙元含量最高，抽茎区段次之，接着是嫩茎区段，其后为老茎区段和底层区段，须根及地上茎基部段的含量很低。这些研究为工业化生产皂素以及适宜培养条件的选择提供了科学的依据。

薯蓣皂甙元作为药物合成的原料，主要通过植物自然合成，有时还可通过对植物的生长进行人工干预以提高其收率，手段包括施加植物生长调节剂、形成愈伤组织以及开展细胞克隆技术等。对于植物中薯蓣皂甙元的提取，目前已经形成了比较完善的生产工艺，较为常用的提取方法主要有以下几种。

1　酸水解法

1.2　常规酸水解法

常规酸水解法是在酸性溶液中（多采用盐酸或硫酸水溶液）使薯蓣皂甙水解为甙元，再用亲脂性溶剂将甙元提取出来。其样品制备过程可分为水提物水解、醇提物水解和直接水解。薯蓣皂甙元是薯蓣属植物中薯蓣皂甙的配基，主要以薯蓣皂甙的形式与纤维素结合存在于细胞壁中，由于细胞壁比较坚韧，因而经典的酸直接水解法仅能提取约四分之一的皂甙元。传统直接酸水解工艺进行黄姜水解产物生产存在以下问题：一是原料直接水解不彻底，大量的纤维素和淀粉的存在对水解有干扰作用，因而水解物中皂素含量低。二是原料在水解过程中，多数厂家选择用硫酸进行水解，易形成大量泡沫，致使部分薯蓣随泡沫流失，水解后又直接用水反复洗涤，水消耗量大，在水洗过程中半成品流失严重。三是废水排放量大，环境污染严重^[11]。水解后，还需选择合适的中和用碱，将酸性水溶液进行中和后再行提取皂甙元，否则在干燥水解物时，由于酸度和温度过高会使薯蓣皂甙元破坏。有报道认为，中和至pH值为6时，过滤产生的泡沫会很快消除，而不影响过滤的进行，可能是因为在此pH范围下薯蓣皂甙元溶解性好，不易形成胶体而起泡^[12]。

1.2　两相溶剂水解法

目前总皂甙水解方法主要采用酸水解，另外还有采用两相溶剂水解法，即在酸-水体系中，加入与水不相溶的溶剂，形成新的两相溶剂体系，可避免皂甙及皂甙元脱水而使皂甙元含量降低。都述虎等^[13]通过分析几种典型的酸水解方法，选定硫酸浓度、稀硫酸用量、回流时间和与水不相溶的溶剂（60～90℃石油醚）用量作为考察因素，以粗提物收率、薯蓣皂甙元含量为指标，应用L₉ （3⁴）正交试验设计进行试验，优化穿龙薯蓣总皂甙的水解条件，以提高薯蓣皂甙元的含量与收率。确定了最佳水解条件为:各加2%硫酸和石油醚（60～90℃） 100ml，回流4h。试验证明，采用优化后的水解条件能明显提高薯蓣皂甙元的含量，且重现性较好。

1.3加压水解法

薯蓣皂甙元提取工艺中的酸水解是使甙链断裂生成甙元和糖，常规酸水解法中的水解步骤，直火加热时间较长。韩紫岩等^[14]改进了薯蓣皂甙的水解方法，取穿山龙碎块50g加8%硫酸溶液浸泡24h后，于高压锅中加压水解（101.3～141.8kPa，120℃～126℃） 2h，放凉后取出，过滤，其他步骤同常规酸水解法。通过实验的改进，由原来水解时间6h，缩短为2h。从提取得到的产品薯蓣皂甙元的量可看出，收率提高将近1倍。

2　自然发酵法

由于常规酸水解法制备薯蓣皂甙元，收率低，只有2%左右。如果将原料在酸水解前经过预发酵或称自然发酵（不种入菌种）处理，不但能缩短水解时间，还能提高薯蓣皂甙元的收率。据报道在酸水解前将原料进行预发酵处理，黄姜能提高收率40%，穿山龙能提高收率54%左右。王元兰等^[15]采用预发酵法对盾叶薯蓣中的皂甙元进行提取，并对发酵时间对收率的影响进行了考察，发现发酵48h收率最高，超过48h收率反而下降，可能是因为长时间发酵产生的大量霉菌影响了薯蓣皂甙元的提取所致。

3　酶解法

唐健等^[11]通过加热恒温发酵生产黄姜水解物，将样品清洗粉碎后加水解酶于40℃恒温发酵24小时，再用稀盐酸水解，水解物平均含量达到15.2%，最高16.13%，最低14.3%，比国内同行业高出10.2%。水解后，采用石灰中和的方法代替传统工艺中直接水洗的方法可以减少排水次数，节约用水量，防止半成品流失。周振起等^[16]将穿龙薯蓣磨碎筛分后加入液化酶，90℃保温0.5小时后降温至60℃，调节pH为4.4，加糖化酶保温8小时，糖渣用盐酸水解，汽油提取薯蓣皂甙元，糖液用于生产酵母菌。皂甙元收率提高约50%。周雨丝等^[17]用糖化酶改良法得到的皂素收获率为0.74%，而直接酸水解法收获率为0.60%。张彩霞等^[18]在穿山龙提取过程中加入纤维素酶显著提高了薯蓣皂甙元的收率。佟玲等^[19]在属于皂素提取过程中先加入高温淀粉酶酶解，再进行酸解和后处理。先酶解后酸解比直接酸水解的皂素收率提高28.80%。向纪明等^[20]研究了在酸解前先自然发酵和加入1%苦杏仁酶或1%α淀粉酶酶解工艺，结果表明通过酶解会使黄姜皂素收率提高，一般来说通过自然发酵较没有发酵的皂素收率高10%～20%，加入1%的酶剂后皂素收率会进一步提高10%～20%。采用将原料黄姜带水粉碎后分出纤维素和糖浆状液，纤维素可用于制造羧甲基纤维素；皂素主要存在于糖浆状液中，糖浆状液在自然条件下或加入酶的作用下发酵两天，过滤后得固状物和酶解液，酶解液中含有大量的糖类物质，可用于制造酒精或酵母粉等；固状物再用酸水解，由于消除了部分淀粉和纤维素的干扰，不仅可以节省酸用量，而且水解的更加彻底，提高了皂素的收率。水解后，采用石灰乳中和的方法代替传统工艺中直接水洗的方法，可以减少排水次数，节约用水量，防止半成品流失，环境污染情况也得到大为改善。李国富^[21]等将黄姜根茎浸泡后带水磨碎，先用淀粉酶水解淀粉，使淀粉与皂素分开，再结合酸水解，水解后以石灰乳中和，石油醚提取。该法改善了水解条件，缩短了生产周期，皂素收率比直接酸水解法提高35%以上，同时可分离出纤维素和淀粉开展综合利用。

4　超临界流体萃取法

超临界流体是指处于超过本身的临界温度和临界压力状态时的流体。超临界流体萃取系统具有较快的传质和萃取速度，是近年来新兴的萃取手段之一，具有无污染，效率高等特点。De等^[22]建立了从植物中提取薯蓣皂甙元的超临界萃取方法。萃取过程可采用从酸解后的植物中进行萃取或原植物与酸和超临界流体混合两种方式，然后从流体中回收产物。此方法可有效地从植物中提取薯蓣皂甙元。Ben Liu等^[23]研究了用超临界萃取提取穿龙薯蓣（D. nipponica）薯蓣皂甙元过程中压力、时间和温度对提取率的影响，实验结果表明在3100p.s.i （1 p.s.i=6894.76Pa）压力下作用70min提取率最高，但作用40min即能提取出相对作用70min82%的薯蓣皂甙元。陈钧等^[24]研究超临界CO₂萃取穿山龙水解物中薯蓣皂甙元的工艺条件，采用单因素法确定了超临界CO₂萃取工艺的最佳条件，并对该法作了技术和经济上的评估。确定主要参数为:萃取压力35.0MPa，萃取温度45℃，以95%乙醇为携带剂，携带剂含量为3%，与有机溶剂提取方法相比，超临界CO₂萃取法的收率及纯度均较高，且安全高效。葛发欢等^[25]主要探讨了萃取压力、温度、时间及流量、夹带剂、分离条件等对收率的影响，确定了超临界CO₂萃取薯蓣皂素的最佳条件：萃取压力为29MPa，温度55℃；分离Ⅰ压力为10MPa，温度60℃；分离Ⅱ压力为5.6MPa，温度45℃；分离柱压力为18MPa，温度为70℃； CO₂流量为12 kg/k g原料· h；萃取时间3 h；夹带剂为药用酒精。同时还进行了超临界CO₂萃取薯蓣皂素的中试放大，并和传统汽油法进行比较。超临界CO₂萃取方法比汽油法优越，表现在收率高、提取时间短等方面，两种方法成本相差不大。

此外还有萃取法、超声、微波等技术用于薯蓣皂甙提取。刘锡葵等^[26]比较了两种提取方式，即连续回流和萃取法，发现以萃取法回收率较高，且时间缩短。这些新技术有不同的优点，但都不同程度的存在着生产规模小，成本高的劣势。相反，常规有机溶剂萃取技术尽管存在种种不足，但由于它的生产能力较大，仍为广大企业所首选。

综上所述，我们认为目前采用先用酶解再酸解，再用有机溶剂萃取的工艺是目前较为适用的。这样不但提高了薯蓣皂甙元收率，并且可以有效降低环境污染，且对生产成本没有太大影响。从长远发展看由于生物水解法条件比较温和，不仅皂甙元得率高，而且有利于淀粉及纤维素资源的综合利用，因而更有发展前途^[27]。

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