周萍1 岳思君1 陈宁2
（1.宁夏大学生命科学学院 银川 500212； 2.天津科技大学生物工程学院 天津 300222）
摘要：由胡芦巴无菌茎段诱导形成愈伤组织，并对其进行继代培养。用目视法选择黄绿色、质地疏松、生长速度快的组织块，结合各细胞系薯蓣皂甙元含量，筛选出优良细胞系。
关键词：胡芦巴愈伤组织薯蓣皂甙元细胞系
薯蓣皂甙元是合成甾体激素类药物的重要原料。其结构经改造和合成后，可得到数千种不同的甾体激素类药物，被医药界称为“药用黄金” ，用途十分广泛。目前我国年需皂甙元（包括出口量） 1500吨左右，而我国已有皂甙元厂的年产量尚不足1000吨，主要原因在于原料的供应限制了皂甙元生产。原来生产薯蓣皂甙元，使用最广泛的原料是盾叶薯蓣和穿龙薯蓣。由于薯蓣生长周期长，需4～7年才能采挖，加上需求量越来越大，致使资源趋于枯竭，自然植被破坏严重，同时加剧了水土流失，使生态环境逐步恶化。用胡芦巴作为薯蓣的补充资源加以开发利用，不但可以缓解薯蓣皂甙元原料不足的问题，从而促进甾体类药物的发展，同时还可以降低胡芦巴胶的生产成本，提高资源利用率[1]。自1947年Marker等从其种子中分离合成甾体的原料薯蓣皂甙元之后，人们逐渐对该属的植物进行了研究，以期寻找含有较高含量的新药源[2]。近年来的研究表明，胡芦巴种子中薯蓣皂甙元含量最高可达1.2%，加之其为一年生草本植物，生长速度快，产量高，所以胡芦巴已被用于国内生产薯蓣皂甙元的首选替代原料[3]。
利用植物组织和细胞培养技术生产有用的天然化合物（包括药物、色素、香料和食品添加剂） ，以期不依赖于野生资源，目前已在少数几种植物上获得商业性成功[4]。通过对培养条件的控制及筛选具有高产稳定性能的无性变异系能使次生代谢物含量显著提高。本研究选用胡芦巴高含量皂甙株进行愈伤组织诱导、继代培养，结合测定各细胞系薯蓣皂甙元含量，筛选出优良高产细胞系，为胡芦巴细胞培养生产薯蓣皂甙元奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
由胡芦巴无菌茎段诱导形成的愈伤组织。
1.4 培养基
MS＋2.0 mg/LBA＋0.2 mg/L2，4-D＋0.2 mg/LNAA
1.5 培养方法
选择生长状态良好且色泽淡绿未褐化愈伤组织，接种于含30ml培养基的100ml三角瓶中，置于培养架上培养。每天光照12h，光照强度1200～1500 Lux，培养温度为24℃～28℃。愈伤组织每28天继代1次。
1.6 愈伤组织生长量测定
测鲜重（FW）和干重（DW） ，干重在烘箱中60℃干燥。生长速度以每组织块每天增加鲜重表示。所有数据为3次重复，每次5瓶，共计15瓶的平均值。
接种量＝接种后瓶重-接种前瓶重（g／瓶）
＝载有样品的皿重-空皿重（g／块）
收获量＝收获前瓶重-收获后瓶重（g／瓶）
＝载有收获样品的皿重-空皿重（g／块）
愈伤组织增长量= （收获量/瓶） -（接种量／瓶）
愈伤组织增长率＝（愈伤组织增长量×100） /接种量
1.7 薯蓣皂甙元定量法
1.7.1 标准曲线的制作
标准品来自中国药品生物制品检定所，准确称取纯薯蓣皂甙元标准样品26mg，用石油醚溶解后定容到100ml，摇匀后，用移液管分别取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml标准溶液于10ml具塞试管中。100℃水浴挥干后，加5%香荚兰醛冰醋酸溶液0.2ml和分析纯高氯酸0.8ml，混匀，70℃水浴加热15min，取出用冰水冷却，加冰醋酸9ml，放置30min后，用721型分光光度计在波长为530nm比色[5]。试验重复两次，取平均值。以所取标准溶液的体积数为纵坐标，吸光度为横坐标，制作标准曲线。
1.7.2 样品中薯蓣皂甙元含量的测定
称取0.2～0.4g愈伤组织干样，首先酸水解，然后用150ml球形脂肪抽提器，以石油醚作溶剂，水浴上加热，抽提4～6小时[6]。转移到10ml具塞试管中，100℃水浴挥干，用同样的方法显色、比色。根据标准曲线，确定其中薯蓣皂甙元的含量。
1.8 高产细胞系的筛选方法
根据生长差异和特性差异，采用目视筛选法，对不断继代的愈伤组织细胞系分成许多小区块并都培养于相同的培养基上。将各区块长大的愈伤组织中的一半进行分析，另一半进行继代培养，分析、比较颜色、大小、透明度、含量，直到皂甙元含量保持稳定，绘出细胞系筛选图谱，并测定各细胞系皂甙元含量，最后选择优良细胞系。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的继代培养
新产生的愈伤组织生长28d后，即可将它们剥离下来分成若干小块进行继代培养。几天后愈伤组织开始变褐，无论改变激素浓度还是采取频繁继代等措施，褐变现象均无多大变化，且组织块体积不再增大，生长速率极为缓慢。继代培养大约10d后，就开始长出新鲜疏松的浅黄绿色愈伤组织细胞团，生长速度变快，20～28d后，生长速率达到高峰。以后可能由于培养基中营养物质的逐渐缺乏，或是可能由于外植体本身代谢产物的增多而产生生长抑制剂以及培养基pH值降低等原因，而使生长速率逐渐缓慢下来，转代后30～40d，愈伤组织逐渐停止生长，由浅黄绿色逐渐变成淡棕色或棕褐色而衰老死亡，质地由疏松变成紧密。所以，继代培养4周即可继代1次。图1是根据能否继代培养以及继代培养后薯蓣皂甙元含量的高低所绘制的各细胞系继代图谱。
图1 胡芦巴愈伤组织细胞系继代图谱
a、b...h为各愈伤组织块；“/” ，“|” ，“\”分别表示愈伤组织块各代之间皂甙元含量的减少、不变、增加，变异幅度1%～2%；“.”为高产细胞系位点
2.2 继代培养次数对胡芦巴茎愈伤组织脆散性和性状的影响
本研究发现继代培养次数对胡芦巴愈伤组织的性状和脆散性有一定的影响，结果如图2所示。
图2 继代培养次数对胡芦巴愈伤组织脆散性的影响
从图2中可以看出，愈伤组织的脆散性随着继代培养的次数增加而提高。当继代培养达4次时，脆散性愈伤组织的比例可达60%以上，在自然情况下，外植体在切口处所形成的愈伤组织一般坚实紧密，分化程度较高，而在离体培养条件下，继代培养的不断进行使外植体上形成的愈伤组织逐渐脱离母体的某些影响，转为具有细胞分裂快、结构疏松、缺少有组织的结构等离体条件下愈伤组织生长的特点。
2.3 高产细胞系的筛选
组织培养的愈伤组织存在变异类型，一个看上去正常的、均一的愈伤组织可分裂成一小部分或大部分具有不同形态特征的愈伤组织，或更容易识别的不同颜色的愈伤组织，即它们的生长和特性存在差异。通过筛选变异株，选择代谢产物接近或超过原植株的高产细胞系是进行细胞培养的关键。在细胞系继代培养的过程中，不同细胞系间生长差异很大，且同一系在不断继代培养过程中不稳定。在筛选高产系时，以选为主，同时，将继代培养与测定薯蓣皂甙元含量相结合。用目视法选择浅黄绿色、质地疏松、生长速度的组织块，结合分光光度法检测，筛选优良细胞系，确定高产位点。表1给出了细胞系生长特性。
表1 细胞系生长特性
表1结果表明，生长速度最快的细胞系，其干重可达0.96mg，最低的仅为0.62mg。从8个细胞系中选出3个较优良的细胞系，即05、06、08号，它们的干重都高于0.85mg。07号因为生长速率有下降趋势而被淘汰，其中以06号细胞系性状最佳，其干重为0.96mg，薯蓣皂甙元含量达1.62%，超过原植株35%以上。
3 讨论
在植物细胞培养规模化生产次生代谢产物的过程中，会面临生长缓慢，此生产物含量低以及细胞系不稳定等问题，解决这些问题的基础是细胞株系的筛选[7，8]，因此建立一种简便、快速和有效的高产薯蓣皂甙元细胞系的筛选方法并从大量的细胞系中筛选出薯蓣皂甙元含量高、质地疏松、生长快速的细胞系是规模化生产薯蓣皂甙元的关键。高产细胞株系筛选的一般流程为：选择合适的材料，从不同来源的材料建立细胞培养物，获得大量的细胞系，然后从中选择出次生物质产量高的细胞株系，可以采用比色法、HPLC、MS和放射免疫等方法来加以分析[8]。以前的研究多偏重于提高次生代谢产物的含量，现在已兼顾产物的含量和细胞的生长速度[9]。
本研究采用目视和比色法相结合的方法，快速准确地筛选出高产薯蓣皂甙元的细胞系。采用目视法可初步确定愈伤组织的生长快慢、质地情况及颜色，并快速筛选出黄绿色、质地疏松、生长速度的组织块细胞系。在目视筛选法的基础上，进一步通过继代培养和检测可确定薯蓣皂甙元高产细胞系。
参考文献：
[1]岳思君，苏建宇，陈宁.葫芦巴愈伤组织诱导的初步研究.宁夏农学院学报，2002，23 （4）:31～33
[2]丁平.一种值得研究和开发的资源生物——胡芦巴.中国野生植物资源，1999 （2） : 17～19
[3] MarkerR.E.，Wagner R.B.，Ulsafer P.R.et al.J.Am.Chem.Soc.，1947，69:2242
[4]刘涤.植物生物工程的发展、成绩、前景.生物科学动态，1981，6： 2～131
[5]陈战国，耿征，刘谦光，黄文红.薯蓣皂甙元的分光光度法测定.分析化学，1996，24 （2） :227～229
[6]李明芳，刘选明，刘斌，等.激素对盾叶薯蓣愈伤组织细胞生长和薯蓣皂甙元合成的调控.中国生物工程杂志，2002，22 （3） :71～73
[7]周立刚，郑光植.生产次生物质的植物细胞大量培养.生物工程进展，1991，11:29～34
[8] Cheng ZH，Yu HX，Zhu LH，B chromosome in a rice ancuploid variation. Theor Appl Genet，2000，101: 564～568
[9]陈书安，王晓东，赵兵，等.产藏红花素栀子愈伤组织的诱导和筛选.中国生物工程杂志，2006，26 （6） : 50～54
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