细胞共培养

（一）实验目的

细胞共培养是指不直接接触的两种细胞共同培养在一个24孔培养板中，通过一个内插小杯相隔。其底部为孔径为0.45μm的滤膜，与24孔培养板底相距1～2mm，细胞不能通过，但上、下层细胞分泌的可溶性细胞因子可以通过膜孔传递而互相作用。利用共培养装置可以观察不同种细胞间相互作用，检测细胞功能。

（二）试剂耗材

1.滤膜　一般滤膜孔径为0.45μm；也有其他孔径滤膜：8μm滤膜，内插杯6.5mm。

2.15%RPMI1640培养液，胎牛血清（FBS）0.25%胰酶。

3.不同刺激物　重组白细胞介素1（Interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）。

4.FITC标记的特定荧光抗体、流式细胞仪。

（三）实验流程

以肾小球相关内皮细胞和系膜细胞培养为例，见图1-10。

1.取第二代生长良好的内皮细胞计数后（1×105个细胞/孔）接种于共培养内插小杯的滤膜之上，置于24孔板中培养。

2.另取第二代系膜细胞计数后接种于另一24孔板之中。

3.内皮细胞培养48h后，可分为不同实验组（含不同刺激物），有一组同时加入无血清培养液作为对照。

4.实验组细胞继续培养6h后弃去原培养液，以无血清培养液洗涤内插小杯滤膜上的内皮细胞4～5次后，将其插入含有系膜细胞的24孔板中，继续培养24h。另设一组系膜细胞直接加刺激物而不参与共培养作为共培养体系的系统对照。

5.利用流式细胞仪检测共培养的系膜细胞及对照组系膜细胞分泌表面因子（如细胞间黏附因子：ICAM-1）。

（1）细胞染色：将小孔上的细胞消化下来，然后利用FITC标记的特定荧光抗体进行荧光染色。

（2）利用流式细胞仪检测荧光着色率。

图1-10　细胞共培养体系

（四）注意事项

1.需要对培养基进行合理选择，这对细胞生长状态十分重要。

2.细胞接种的密度很重要，如果细胞生长太紧密，培养时间受限，细胞容易脱落坏死。如果细胞密度太低，数量太少，很难在一定时间内分泌足够的细胞因子，细胞间的相互作用效果不明显。

3.培养环节较多，所以细胞消化要轻柔，否则细胞易破碎，造成染色失败。

4.可利用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测培养上清中细胞外基质成分。

5.可利用溴化二苯四偶氮盐（MTT）法检测细胞增殖情况。

参考文献

[1]傅博，程庆砾，陈香美，等.肾小球内皮细胞对系膜细胞表达细胞粘附分子的影响.中华医学杂志，1996,76:388-389.

[2]李文歌，陈香美，程庆砾，等.用共培养体系观察缺氧肾小管上皮细胞对成纤维细胞的调节作用.中华内科杂志，1996,35:810-813.