第三节 细胞培养技术
细胞培养分为单层细胞培养和悬浮细胞培养。单层细胞培养包括静止培养和转瓶旋转培养，使细胞在器皿的表面生长出单层或数层细胞。单层细胞常用来分离和繁殖病毒；悬浮细胞培养，是指细胞悬浮于营养液中繁殖的一种培养方法，它可进行连续培养，便于工业化生产，常用来繁殖病毒生产疫苗。根据细胞株的不同，细胞培养又分为原代细胞培养、继代细胞培养、二倍体细胞培养和传代细胞培养。原代细胞培养，是指直接从组织消化分散的细胞所进行的第一代体外培养；继代细胞是指将原代细胞消化下来还能继续培养的细胞；二倍体细胞是指染色体的数目和形态正常的继代细胞，其中至少有75%细胞的核型与其动物获得的正常细胞核型相同；传代细胞系指癌变的异倍体细胞，其特点是可无限地传代培养。
细胞培养能否应用以及是否成功，主要取决于四方面因素，即培养液、血清、辅助试剂及环境。动物病毒分离主要使用细胞单层，下面介绍常用细胞单层培养方法以及与之有关溶液的配制。
一、细胞培养相关溶液的配制
1.抗生素的配制及使用浓度抗生素的贮存浓度通常为使用浓度的100～200倍。特别是在细胞正常传代时尽量避免使用，或仅用100IU/ml青链霉素。其他抗生素是在做病毒分离、鉴定时，怀疑污染或已出现某种污染时才参考使用。
2.7.5% NaHCO3的配制
成分：NaHCO375g，双蒸水1000ml。
制备方法：将NaHCO3溶解在灭菌双蒸水中。用正压滤器除菌。分装于50～100ml灭菌瓶中，盖紧盖子。取1～5ml接于硫乙醇酸盐（T，G）培养基中进行无菌检验。普通冰箱或室温贮存。
3.0.5%酚红的配制
成分：酚红5g，NaOH（0.1mol/L）150ml，双蒸水850ml。
制备方法：逐滴将0.1mol的NaOH加入酚红粉末中，研磨直至完全溶解。加双蒸水至1000m1，分装于100～500ml瓶中。在121℃条件下高压灭菌15min。取1～2ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于室温或普通冰箱，盖子要盖紧。
4.无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（2.5%）的配制
甲液：成份：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，CaCl2·2H2O 0.132g MgCl2·2H2O 0.1g，双蒸水800ml。
乙液：成分：Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.2g，双蒸水200ml。
制备方法：依次称取各试剂并依次溶解在双蒸水中。以121℃15min高压灭菌甲液和乙液。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中并不断搅拌，最终pH7.0。分装于500～1000ml灭菌瓶中。取1～5ml接于T.G中进行无菌检验。贮存于普通冰箱。
（2）无钙、镁PBS的配制：将上述PBS中的钙盐和镁盐去掉，将其他试剂溶解于蒸馏水中即成。
（3）2.5%无钙镁PBS胰蛋白酶溶液的配制
成分：无钙、镁PBS1000ml，胰酶（1∶250）25g。
制备方法：加胰蛋白酶于无钙、镁PBS中，搅拌使其溶解。用赛氏滤器过滤除菌，分装于200～500ml灭菌瓶中。取1～5ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于－20C。
5.Versene溶液（0.02%）的配制
成分：NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 1.15g，乙二胺四醋二钠（EDTA）0.2g，双蒸水1000ml。
制备方法：分别称取试剂，并按顺序依次溶解。分装于50ml瓶中。121℃高压灭菌15min。保存于室温。
6.Versene胰蛋白酶溶液的配制
无菌操作。取无钙、镁PBS胰蛋白酶溶液（2.5%）5ml，Versene溶液（0.02%）45ml；充分混合即得。
7.Hank’s平衡盐溶液+贮存液（HBSS，10×）的配制
甲液成分：NaCl 80g，KCl 4.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，MgCl2·6H2O 1.0g，CaCl2 1.4g，葡萄糖10g，双蒸水800ml。
乙液成分：NaH2PO4 1.15g，K2HPO4 0.2g，双蒸水200ml。
制备方法：依照上列顺序称取各试剂，并依次溶解于水中。将甲液和乙液分别121℃高压灭菌10min或过滤除菌。冷却后，将乙液缓慢加入甲液中，并持续搅拌。分装于100～500ml灭菌瓶中，盖紧塞子。贮存于室温或4℃。
使用时用灭菌双蒸水稀释，根据需要加入酚红指示剂（终浓度百万分之二十）、青霉素、链霉素或用NaHCO3调pH到所需值。
8.Earle’s平衡盐溶液
（1）贮存液（EBSS，10×）的配制
甲液成分：NaCl68g，KCl4.0g，MgSO4·7H2O 2.0g，Na2HPO4·H2O 1.40g。
乙液成分：CaCl2 2.0g，双蒸水200ml；
制备方法：依次称取各试剂并依次溶解于双蒸水中。以约121℃15min分别高压灭菌甲液和乙液。冷却后，将乙液加入甲液中并缓慢搅拌。分装于100～500ml灭菌瓶中，盖紧瓶盖。取1～5ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于室温或4℃。
（2）使用液的配制
将EBSS（10×）做10倍稀释，方法同Hank’s平衡盐溶液使用液的配制。
9.5%水解乳蛋白溶液的配制（LH）
成分：水解乳蛋白50g，双蒸水1000ml。
制备方法：称取水解乳蛋白并溶解于双蒸水中，可通过56℃水浴加热。分装于100～200ml瓶中。121℃高压灭菌10min。取1ml接于T.G培养基中进行无菌检验。贮存于4℃或室温。
10.细胞生长液的配制 培养液一般不能单独作细胞培养用，应根据需要和说明书上的规定，加入适当比例的小牛血清或胎牛血清、双抗和酚红等，并用NaHCO3调节pH值。有的还要求加入谷氨酰胺。
下面是两种常用的细胞生长液配方。
细胞生长液Ⅰ：主要用于鸡胚成纤维细胞和原代肾细胞的培养。
成分：灭菌双蒸水72.5ml，水解乳蛋白溶液（5%）10.0ml，Earle’s10×（或Hank’s10×）9.5ml，犊牛血清5.0ml，青霉素1.0ml，链霉素0.5ml，NaHCO3（7.5%）1.0ml，总量100ml；
细胞生长液Ⅱ：细胞生长液Ⅱ应用范围很广，但不同细胞对血清的含量要求会有不同。如鸡胚成纤维细胞、BHK21等细胞的培养要求5%的血清含量；IB－RS－2等细胞的培养要求10%的血清含量；鸭胚肝细胞等的培养要求20%的血清含量；胎驴原代细胞和皮肤原代细胞的培养要求30%的血清含量。当上述配方中血清含量变化时，则相应调整其他溶液的量，抗生素和NaHCO3的含量不变。
成分：灭菌双蒸水33.5ml，水解乳蛋白溶液（5%）4.5ml，Earle’s10×（或Hank’s10×）4.5ml，199培养基（或E－MEM培养基）45.0ml，犊牛血清10.0ml，青霉素1.0ml，链霉素0.5ml，NaHCO3（7.5%）1.0ml，总量100ml。
11.细胞维持液的配制 将上述细胞生长液中的血清含量降为1%～2%，其他成分做相应的调整即为细胞维持液。但有的细胞维持液血清含量仍然要达到15%～20%（如胎驴原代细胞和皮肤原代细胞等）。传代细胞的维持液常常可以不加血清。
12.水产动物细胞生长液 用Earle’s盐溶液配制的D－MEM、L－15、L－100培养基5%～20%的胎牛或犊牛血清（初代培养血清用量为10%～20%，继代培养血清用量为5%～10%）。不同动物细胞应注意渗透压的调整。
水产动物细胞生长液渗透压的调整：由于水产动物种类繁杂，其细胞渗透压有一定差异，所以作为哺乳动物细胞培养用的E－MEM在用于水产动物细胞培养时，有时需要做一定的调整。
13.水产动物细胞维持液的配制 降低水产动物细胞生长液中血清含量至1%～2%，生长液中其他含量做相应的增加。水产动物细胞消化液也用Versene胰蛋白酶溶液。因作用时间短，可不必调渗透压。
14.细胞计数用结晶紫溶液的配制
成分：结晶紫1.0g，柠檬酸19.2g，蒸馏水1000ml。
制备方法：先将柠檬酸溶解在蒸馏水中，然后加结晶紫，待完全溶解后贮存于室温。
15.硫乙醇酸盐（T.G）培养基的配制
成分：酪胨15.0g，酵母浸出粉5.0g，葡萄糖5.0g，硫乙醇酸钠0.5g，L－半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂粉0.5g，NaCl2.5g，0.2%美蓝溶液0.5ml，蒸馏水1000ml。
制备方法：称取上述各试剂，边搅拌边加于500ml蒸馏水中。溶解后，补足蒸馏水至1000ml。摇匀后，分装于试管中，每5ml分1支试管。高压灭菌，121℃15min。避光保存于室温。
16.细胞培养基（D－MEM、199、L－15、L－100等） D－MEM是目前广泛应用的培养基之一，基中含多种氨基酸、维生素以及一些有机物质和无机物质。市场上有成品D－MEM出售，无需自己配制。199、L－15、L－100细胞培养基也是目前广泛应用的培养基，与D－MEM在成分上有一定差别，也以使用成品为佳。成品培养基出厂前经过了物理检验、化学检验、稳定性检验、微生物检验、内毒素检验、细胞毒性试验和细胞生长试验，因而质量稳定可靠。使用成品可以提高工作质量和效率。目前市场上出售的培养基既有液体的，也有干粉的。干粉培养基更利于保藏和运输，使用时只需按说明书加入双蒸水，溶液过滤除菌后即可使用。
不同产品批号的培养液成分略有不同，培养液有含Hank’s和Earle’s两种。其区别在于前者氯化钠为0.85%而后者为0.65%，渗透压有所不同，应根据培养的细胞对象选择购买。干粉培养基可保存于－20℃，液体DMEM应贮存于2℃～8℃。
二、动物细胞培养方法
（一）原代肾细胞培养
1.以无菌术采取新屠宰的动物肾脏，置于灭菌平皿中。
2.用无菌剪刀、镊子去除被膜、结缔组织和血块；将肾从中剪成两半，去除髓质；用Hank’s平衡盐溶液冲洗二次后转移至灭菌小烧杯中；将肾皮质剪碎（约1mm3）；用Hank’s平衡盐溶液洗二次去除血液。
3.加约25ml预温的（37℃）Versene胰蛋白酶溶液（0.25%），通过磁力搅拌5min。弃掉第一次消化下来的细胞，加25～30ml新预温的Versene胰蛋白酶溶液，继续磁力搅拌15min。
4.将细胞悬液通过2层纱布过滤，将滤液收集于含10ml细胞生长液的200ml离心管中，置于洗浴中或普通冰箱中。未消化好的组织块按上述方法再次重复消化，直至全部消化过滤完。
5.将几次消化收集的细胞悬液在4℃下以1000r/min离心10min，弃掉上清液，立即加入细胞生长液。每支离心管加30～50ml细胞生长液悬浮细胞沉淀。
6.将细胞悬液转入50ml刻度离心管，以1000r/min离心10min，弃掉上清液；用细胞生长液重悬细胞沉淀，然后补加细胞生长液至适当的浓度。一般以1∶200～1∶400稀释为宜，主要取决于细胞来源于何种动物的肾脏。
7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶（板、管中），于37℃培养箱中培养。
如果需要细胞计数，可按下述方法进行：取上述第五步制成的细胞悬液0.5ml，加入1ml结晶紫溶液，混匀后加到血细胞计数板上。计数板上有2个计数室，计数每个计数室中的5个计数池（即计数4个角和中间计数池中的细胞），这样共需计数10个计数池。每个计数池体积为0.1mm3，10个计数池体积共为1mm3，即可容纳1μl细胞悬液。也就是说，10个计数池所计数的细胞即为1μl细胞悬液中的细胞计数。由于结晶紫溶液的加入使细胞悬液稀释了3倍，所以实际lμg细胞悬液的细胞数量应乘3倍。1ml细胞悬液的细胞数量：M×3×103，其中M为10个计数池中的细胞数量。
细胞培养：用细胞生长液稀释细胞悬液至每毫升3×105个细胞，进行细胞单层培养。
（二）原代鸡胚成纤维细胞的培养
1.选择9～10日龄鸡胚（或12～14日龄鸭胚），用70%酒精消毒外壳。
2.从气室端打开卵壳，取出鸡胚，去头、脚和内脏，将躯干置于一灭菌小烧杯中，用预冷的Hank’s平衡盐溶液冲洗，用灭菌剪刀剪碎。
3.用预冷的Hank’s平衡盐溶液充分冲洗组织碎块以尽可能地去除血液；用37℃预温的Versene胰蛋白酶溶液冲洗一次；再加20～50ml同样的Versene胰蛋白酶溶液，通过磁力搅拌，于37℃消化15min。
4.通过2层纱布过滤细胞悬液，将滤液收集于灭菌离心管中，以1000r/min离心10min，去掉上清，用预冷的Hank’s平衡盐溶液同样洗涤2次。
5.去掉上清液，加细胞生长液制成10%的悬液（1ml细胞沉淀加9ml细胞生长液），于4℃可保存3～4d；用细胞生长液再作1∶40的稀释（终浓度1∶400），然后分装到培养瓶中，于37℃培养48h即做细胞培养用。
（三）传代细胞BHK21的培养
1.培养2～3d，选择生长良好的BHK21细胞单层。
2.弃掉培养液，加入Versne胰蛋白酶溶液，以刚能浸没细胞单层为宜。
3.室温下培育30～60s，或发现细胞层不透明、发白，开始卷边为止。
4.轻轻翻转细胞瓶使细胞面在上，在脱离胰蛋白酶溶液的情况下于37℃再培养2～3min。
5.倾出胰蛋白酶溶液，加入细胞生长液，其量为原细胞生长液的4倍，即细胞做4倍稀释。细胞生长液中使用小牛血清，其含量以5%～10%为宜。
6.轻轻拍打细胞培养瓶，使细胞分散。
7.分装细胞瓶（板、管），于37℃培育。应在48h内长成单层供使用。
（四）其他传代细胞的培养
其他传代细胞的传代培养与BHK21细胞基本相同。不同细胞需要的生长时间、胰蛋白酶溶液的浓度及消化细胞的时间可能会有不同，传代时稀释的倍数也不同，通常在1∶2～1∶8之间。细胞生长液的不同主要是对其中的血清要求和用量不同，有的用小牛血清，有的则需要用胎牛血清。血清用量一般为5%～15%。由于商品血清质量差距较大，所以实验者应有自己的经验。
（五）继代细胞培养
1.倾出培养瓶中原有的细胞生长液，加入无钙、镁的PBS冲洗一次细胞表面。
2.加入Versene胰蛋白酶溶液，室温下不时摇动细胞瓶，直至细胞层发白、卷边，即将落。
3.倾出消化液，轻拍培养瓶，摇散细胞，再加入细胞生长液，并进一步摇散细胞。
4.根据细胞生长情况，按1∶2或1∶8分装培养瓶，培养于适宜温度，应于36h内长成单层。
三、细胞培养中常见问题及其处理
1.利用抗生素消除细胞中的污染当一个重要的无法取代的组织细胞被污染后，研究人员要想方设法控制或消除污染。首先应清楚污染物是细菌、真菌、酵母菌还是支原体，然后有针对性地选用消毒工作环境、培养箱的消毒剂和细胞培养用的抗生素。抗生素的浓度过高对某些细胞会产生毒性，所以，在使用抗生素消除污染物之前，要进行药物安全剂量试验，以测定出某一种抗生素对某一种细胞的毒性剂量。特别是两性霉素B和泰乐菌素。测定毒性剂量和消除细胞中的污染物的方法如下。
（1）用无抗生素的细胞生长液分散、稀释细胞，将细胞稀释至正常细胞传代的浓度。
（2）将细胞悬液加至细胞培养板的各个孔中（或几个培养瓶），按梯度浓度将选择的抗生素加到各个细胞孔中。比如两性霉素B可按0.25、0.50、1.0、2.0、4.0、8.0μg/ml的量分别加入各细胞孔中。
（3）每日观察对细胞的毒性作用，比如细胞脱落、出现空泡或生长减慢等。
（4）当抗生素剂量测定后，以低于毒性剂量1～2倍的剂量加入细胞生长液中，用这种抗生素细胞生长液将细胞培养2～3代。之后再用无抗生素的细胞生长液培养传代至4～6代，以观察污染是否被去除。
2.细胞的保存与复苏
（1）细胞短期保存：细胞单层长满后，更换新细胞生长液，置于比该细胞最适生长温度低5℃～8℃下保存，可存放1～4周（根据不同细胞而定）。细胞单层长满后，更换新细胞生长液，静置于4℃，可存放2～6周（根据不同细胞而定）。经过以上存放的细胞会有部分细胞死亡，一般通过二代传代培养，可恢复细胞的正常生长状态。
（2）细胞的长期保存：用Versene胰蛋白酶溶液按常规消化细胞单层，离心收集细胞2次（500r/min，10min）。将沉淀的细胞通过离心管上的刻度定其容量，按每0.5ml沉淀细胞加8.5ml细胞生长液和1ml二甲基亚砜（DMSO）的比例，将三者混匀，每1ml分装1只安瓿。将安瓿集中放在盒中，分以下三步缓慢降温。置4℃2h。置－20℃2h或至安瓿中的液体冻结为止。置－70℃2h超低温冰箱或液氮中，放在液氮中可保存数年。
（3）从冷冻状态复苏细胞。要迅速解冻，取出安瓿后立即投入37℃水浴中。这一过程应做好人身防护，因为安瓿有时会炸开。用70%酒精浸泡消毒，然后打开安瓿，将细胞悬液转入离心管中，补加细胞生长液，以500r/min离心10min去掉DMSO。这一过程要快，因为DMSO在室温下对细胞有毒性。加细胞生长液使细胞浓度由保存时期的5%变为0.2%。分装于培养瓶中，分装量因培养瓶不同而不同。贴壁后（通常约24h），轻轻倾出旧液，换新的细胞生长液继续培养。
四、利用动物细胞培养分离病毒
自从人们发现能够利用动物细胞复制脊髓灰质炎病毒以来，细胞培养物已成为分离病毒最简便、应用最广泛的一种方法。由于不同的病毒适应的细胞不同，所产生的细胞病变也不同，所以，这里介绍一般制备方法。
1.选择刚刚长满的细胞单层（36h内长满80%以上单层），要求无污染，形态正常。
2.弃细胞生长液，每个细胞瓶（或管、或孔）加入样品溶液，以浸没细胞单层为宜。置37℃吸附60min，若样品溶液很少不能浸没细胞单层时，可将细胞瓶置于摇床上，缓慢摇动，使样品不断浸润全部细胞单层。
3.补加5倍或10倍于样品溶液的细胞维持液（其中犊牛血清要保证不含某种特异性病毒抗体或不加血清），于37℃培育。对毒性物质含量较高的样品（如粪便样品），加维持液之前可将样品溶液去掉。
4.每天观察细胞病变（CPE），发生CPE时，再接种另一批同样的细胞培养物，以获得更充足的鉴定材料。CPE的判定一定要以健康对照细胞成立为前提。
5.对48h或72h（其他病毒依照CPE出现时间而定，通常在7d以内）仍不出现CPE的细胞瓶，将其冻融一次，用其收获液按上述方法盲传2～3代，若仍不出现CPE，视为阴性。但必要时要继续传代。
注：吸附过程是必要的，特别是分离病毒初代接种，可提高分离病毒的效果。当病毒含量很少时，若不经吸附直接加人细胞维持液，等于稀释病毒，减少病毒与质膜的结合几率，这样即使有病毒也可能不产生CPE，从而被误认为是病毒阴性。
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