融合体的再生与杂种植株的鉴定

原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后通过愈伤组织或胚状体分化出完整植株的过程。

细胞壁再生是细胞分裂的先决条件。再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。再生过程中，质膜先合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，在质膜和片层结构之间或在膜上又产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。常用检测新壁合成的方法有荧光增白剂法（calcoflower white 0.1%）和电镜技术。

融合体再生过程中也可能存在体细胞变异，因此必须对原生质体融合再生的植株进行杂种真实性的鉴定。目前可以通过形态学、细胞学、生物化学和分子生物学、遗传学等方法进行鉴定。

1）形态学鉴定

形态学的差异可以作为体细胞杂种鉴别的基本依据。植株叶片大小及形状、花的颜色及花形、株型和株高等均可以作为鉴定杂种的标记，早期愈伤组织的结构、颜色也可以作为判别杂种的依据。体细胞杂种的形态学特征有两种类型：一种是呈现双亲中间类型，多出现在对称融合的杂种中；另一种是与亲本之一形态特征类似，多为非对称融合产生的杂种。

2）细胞学鉴定

流式细胞仪倍性测定的染色体数目及大小、核型、着丝粒及随体的位置是鉴定体细胞杂种的主要依据。对于亲缘关系较近的物种，染色体差异不大，需要进一步借助染色体显带技术来区分。

3）同工酶鉴定

同工酶是广泛应用于体细胞杂种鉴定的生化标记。过氧化物酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氧酶等多种酶类均可用于体细胞杂种鉴定。

4）分子标记鉴定

使用分子标记对杂种进行鉴定是一种非常有效的方法。迄今为止，用于鉴定体细胞杂种使用的分子标记包括RFLP（restriction fragment length ploymorphism），RAPD（random amplified polymorphic DNA），SSR（simple sequence repent），5S rDNA间隔序列和Southern杂交等。RFLP标记是发展最早的DNA标记技术，其多态性和重复性好，但DNA量要求大，质量要求较高，操作步骤较复杂。RAPD是使用较早且操作较方便的一种分子标记。SSR属于短串联重复序列，其扩增位点较丰富、重复性好，也被广泛用于杂种的鉴定。真核生物中的5S rDNA是一类高度保守的串联重复序列，其编码区序列保守，可以以此设计PCR引物，用来选择性扩增非转录间隔区，鉴于间隔区的序列及长度在不同物种间差异较大，可进行体细胞杂种的鉴定。

5）原位杂交技术

原位杂交技术为检测外源染色质的渗入提供了有效的手段，通过原位杂交可以确定杂种中染色体的来源，分析核基因组的构成。Wolters等（1994）使用原位杂交的方法鉴定出马铃薯与番茄体细胞杂种中染色体发生了重排。Collonnier等（2003）利用基因组原位杂交（GISH）分析栽培种茄子与野生种茄子S.torvum体细胞杂种中亲本染色体的来源。Wang等（2011）利用GISH发现部分非对称融合杂种愈伤组织供体染色体片段（川西樟牙菜）插入到受体染色体（狭叶柴胡）中，并且随着紫外照射剂量的增加，供体染色体消减得愈多。