植物原生质体融合

植物实验生殖生物学与生殖细胞工程：现在与未来

植物生殖生物学是植物实验胚胎学的新阶段，其主要特征为操作技术水平的提高与多学科综合性研究的加强。花粉原生质体、生殖细胞、精子、胚囊、卵细胞的操作、雌雄配子体外融合、配子—体细胞杂交等，代表了当前的主要研究趋势。实验生殖生物学与基因工程相结合，开辟了植物生殖工程新技术领域的前景，对生殖工程的意义与内容提出了轮廓设想。

作者在几年前的一篇评述中曾经讨论了植物生殖生物学作为一个新的学科生长点的主要特征^[1]。其实，从1968年召开第一次“种子植物有性生殖的细胞生物学”国际讨论会算起，到最近植物生殖生物学被公认为一门新学科，经历了20多年的孕育才达到瓜熟蒂落。现在，在生殖生物学中又出现了一个活跃的研究领域，它有演进为一门新分支学科并导向一个新技术的趋势，值得我们提出来讨论。这里所说的新分支学科，可以命名为“植物实验生殖生物学”；新技术领域可以命名为“植物生殖细胞工程”或简称为“植物生殖工程”。

一

实验生殖生物学是实验胚胎学发展的更高阶段，是生殖生物学时代的实验性分支学科。从实验胚胎学到实验生殖生物学，有继承的一面，更有发展的一面。这里着重讨论后一方面。从近年研究的动态看来，有两个主要的特征说明其质上的变化。

第一个特征是实验操作技术由器官、组织水平提高到细胞、原生质体水平。实验胚胎学所依赖的操作技术，如花药培养、子房与胚珠培养、试管受精、胚胎培养、胚乳培养等，基本上是器官与组织的操作，这从Johri（1982）主编的《维管植物的实验胚胎学》一书中的各章内容可以清楚地看出。但是所有这些器官、组织水平的操作都在以不同程度的势头向更加精密化的、细胞与原生质体水平的操作技术迈进。例如就雄性系统而言，60年代突破了花药培养；70年代发展到花粉培养；80年代又在花粉原生质体、精子和生殖细胞的操作方面取得长足的进展，成为当前研究的热点。关于这方面的具体成就，我们将有另文综述，这里仅举出最近的一些突出苗头：通过花粉四分体原生质体和体细胞原生质体融合以进行“配子—体细胞杂交”已经再生杂种植株；大量分离和纯化花粉原生质体的技术已在几种植物中完全成功；由花粉原生质体培养已诱导了多细胞团与类似原胚的构造，突破了其孢子体发育的第一关；大量分离精子及其前身生殖细胞已在多种植物中过关；等等。以上种种，在不久前的实验胚胎学著作中还没有反映或仅属推测，今天已经成为现实，足见其进展之迅猛。就雌性系统的操作而言，60年代成功突破了传粉后的子房与胚珠培养；70年代以后又成功突破了未传粉的子房与胚珠培养；到了80年代，人们已经采取实际步骤向胚囊和卵细胞的操作前进，其第一步——生活胚囊、胚囊细胞原生质体的分离已经突破。如果雌、雄两方面的细胞与原生质体操作技术都达到相当成熟的地步，就可以开展雌雄性细胞体外融合的实验，实现以往所提出的“受精工程”的设想。到那时，过去名为“离体受精”实则离体授粉的技术（器官水平的操作）将演进为高等植物真正含义的离体受精（原生质体水平的操作），这并非太遥远的目标。

实验生殖生物学的第二个主要特征是其多学科综合性研究的性质较以往更为显著。以往的实验胚胎学，主要是在胚胎学中融入了生理学和遗传育种的成分。Maheshwari与Rangaswamy（1965）所撰长篇综述《与生理学和遗传学相关联的胚胎学》即体现了这一特征。诚然，在某些（尤其是近年）实验胚胎学研究中也加强了细胞生物学与分子生物学的内容，但无论广度与深度都是很不够的。在当代实验生殖生物学研究中，细胞生物学、分子生物学等多学科的渗透上升到重要地位，各种新的研究方法不断被用来揭示生殖过程的奥秘。如应用超微结构和超微组化技术、荧光显微术、活体观察与视频显微术、图像处理术、显微定量测定术、放射自显术、免疫学技术以及分子生物学技术，从不同角度对同一问题作深入细致的探索，在有关研究报道中日有所见。这里仅以围绕精子分离进行的多学科研究为例：分离精子的目的最初是为了观察它们在离体条件下的形态变化与运动性能，以后发展到观察在分离状态下的雄性生殖单位与精子二型性。最近，由于雌、雄识别的研究逐渐由花粉与雌蕊的识别向配子间的识别深入，加之关于“倾向受精”的认识表明被子植物的一对精子分别具有与卵细胞或中央细胞识别的能力，目前已着手分离精子的免疫学鉴定，旨在探讨精子的识别物质。由此可以看出，精子分离不只是一个操作技术的问题，而是涉及到细胞生物学、生理学、生物化学、分子遗传学等多个相邻学科，囊括了分离提纯、活体观察、超微结构、生活力测定、冷冻保存、单克隆抗体制备、免疫学测定、蛋白质分子分离与鉴定、原生质体融合等多种研究技术方法。这个例子可以很好地反映当代实验生殖生物学多学科综合性研究的特色。当然，所谓多学科综合性研究是就整体而言的，并不意味着排斥为了特定目的而进行的单项研究，这正如上文所述，实验生殖生物学的操作水平从整体上已进入细胞与原生质操作的阶段，并不意味着排斥器官与组织的操作，其道理是不言自明的。

二

现在再讨论实验生殖生物学向应用方面延伸的问题。实验生殖生物学的强大生命力不仅表现在探索未知方面，而且表现在通过它开拓生殖工程应用技术的前景方面。依我们看，“生殖工程”的含义包括整个有性生殖过程的控制与利用，比“受精工程”的范围更广。它标志着人类通过生殖过程改造植物遗传性的能动性达到一个新的高度。

首先让我们从宏观上考察一下近代植物改良基本途径的演变动态。近代植物改良的主要途径是通过有性杂交结合双亲的遗传物质，即通称常规杂交育种。60年代以后，出现了两方面的重大突破：一是细胞与原生质体培养技术的建立，证实了植物细胞的全能性，初步实现了高等植物细胞的“微生物化”；二是在分子遗传学的基础上发展了基因工程技术。二者的结合导致了植物细胞工程技术的兴起；后者由于是以体细胞及其原生质体为主要实验体系的，实际上可说是体细胞工程。体细胞工程的成就表明人类可以在常规有性杂交之外增加一条通过体细胞培养改良植物的新途径。与此同时，实验胚胎学所创造的一系列方法也成功地用于单倍体育种和远缘杂交育种。在这样的背景下，人们对生殖系统的机能与利用潜力就投以新的眼光，试图通过实验生殖生物学的努力和借助体细胞工程的经验开辟生殖工程的新局面。可以预测，从现在开始的一二十年内将会有一个研究生殖工程的高潮。

既然有体细胞工程，何必还需要生殖工程呢？为了回答这个疑问，有必要分析生殖工程的特点和优点。我们认为至少以下三点是很明显的：第一，有性生殖毕竟是植物的自然生殖过程，是无性的或准性的生殖过程无论如何不能完全取代的。换言之，就多数植物来说，通过有性过程繁衍后代是一条顺乎自然的因而也是阻力较小的途径，并且近年来有些研究表明，通过这一过程施行基因工程也是可行的。现在认为：花粉管不仅是雄配子的运载工具，而且具有外源基因载体的功能；卵细胞由于部分地缺壁，类似天然的半原生质体状态，这不仅是对受精的适应，而且也具备了基因工程受体的特征；至于合子，作为天然的胚胎发生原始细胞，其优越性更是毫无疑义的。因此，借助有性生殖细胞施行基因工程的设想在理论上是经得起论证的。现在的问题还是在实际操作技术上有些方面尚未过关。第二，生殖系统中拥有许多天然的单倍细胞，由它们可以直接制取单倍原生质体。小孢子四分体、小孢子、花粉粒、花粉管、生殖细胞、精子、大孢子、胚囊、卵细胞与其他胚囊成员细胞，都是单倍细胞，其中有些细胞（如精子）还是天然的原生质体。单倍原生质体在遗传工程中的价值毋庸赘言。但迄今获得单倍原生质体的方法是先通过花药培养或其他途径诱导单倍体植株，然后再从后者的细胞制取原生质体，这种间接的方法是相当麻烦的。如果由生殖系统所提供的单倍原生质体能够培养和操作，将在遗传工程中显示巨大的优越性。第三，生殖系统中蕴藏着丰富多样的细胞类型，尤其在细胞质方面差异很大。如卵细胞有丰富的细胞质；精子的细胞质相对贫乏，犹如天然的核质体。在一粒花粉中的两个精子，细胞器的种类与含量也可能有很大差别，如白花丹的二型精子，一个富含质体，另一个富含线粒体。这将成为开展细胞器工程的好材料。因此，把生殖系统中可供利用的细胞开发出来，可以建立各种有特色的细胞工程实验系统，潜力是不小的。

虽然现在我们对植物生殖工程的远景还只能勾画出模糊的轮廓，但对近中期的目标可以作出比较明确的估计。这里提出一些具体的设想：①建立花粉原生质体培养再生植株的技术，在此基础上利用花粉原生质体进行融合与转化实验；②建立花粉原生质体萌发花粉管并以其进行授粉、受精的技术，利用花粉原生质体摄取外源DNA并导入受精卵；③探索花粉生殖细胞培养启动细胞分裂与再生植株的可能性；④开展花粉原生质体、生殖细胞或精子与体细胞原生质体融合的实验，建立各种“配子—体细胞杂交”技术；⑤研究分离精子保存技术，建立“精子库”；⑥胚囊及其成员细胞的培养，争取启动细胞分裂与胚胎发生；⑦雌、雄配子的体外融合；等等。这些目标的实现将打开通向未来生殖工程的道路。

最后作一个简略的归纳：植物生殖生物学是以认识植物生殖过程自然规律为内容的基础研究学科。植物生殖工程是通过生殖过程改良植物的应用技术领域。而实验生殖生物学则是把二者联结起来的桥梁，是基础研究与高技术的一个结合点，我们应当给以足够的重视。

（原载《植物学通报》，1989年第6期，作者：杨弘远、周嫦）