核黄素(riboflavin)即维生素B2(vitamin B2)，核黄素为橙黄色针状结晶化合物，味苦。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。核黄素是机体许多重要辅酶的组成成分，对机体内糖、蛋白质、脂肪代谢起着重要作用。主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。
1.荧光法
1)原理
核黄素在440～500nm波长光照射下发出黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比，在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为样品中核黄素所产生的荧光强度。
2)试剂
①盐酸(0.1mol/L)。
②氢氧化钠(1mol/L)。
③氢氧化钠(0.1mol/L)。
④硅镁吸附剂: 60～100目。
⑤乙酸钠溶液(2.5mol/L)。
⑥低亚硫酸钠溶液(200g/L): 此液用时现配。保存在冰水浴中，4h内有效。
⑦洗脱液: 丙酮+冰乙酸+水(5+2+9)。
⑧溴甲酚绿指示剂: (0.4g/L)。
⑨高锰酸钾溶液(30g/L)。
⑩过氧化氢溶液(3%)。
木瓜蛋白酶(100g/L): 用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。
淀粉酶(100g/L): 用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。
核黄素标准溶液的配制(纯度98%)。
核黄素标准储备液(25μg/L): 将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过24h后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4m L冰醋酸和1.5L水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至2L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，冰箱中保存。
核黄素标准使用液: 吸取2.00m L核黄素标准储备液，置于50m L棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg核黄素。
3)仪器
①高压消毒锅。
②电热恒温培养箱。
③核黄素吸附柱(见图10-4)。
④荧光分光光度计。
4)分析步骤
(1)试样提取
①试样的水解: 准确称取2～10g样品(含10～200μg核黄素)于100m L三角瓶中，加50m L0.1mol/L盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40m L瓷坩埚为盖扣住瓶口，置于高压锅内高压水解，1.03×105Pa30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，取少许水解液，用0.4g/L溴甲酚绿检验呈草绿色，p H为4.5。
②试样的酶解: 含有淀粉的水解液: 加入3m L10g/L淀粉酶溶液，于37～40℃保温约16h。
含高蛋白的水解液: 加3m L10g/L木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保温约16h。
图10－4 核黄素吸附柱
③过滤: 上述酶解液定容至100.0m L，用干滤纸过滤。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。
(2)氧化去杂质
根据试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液及核黄素标准使用液(含1～10μg核黄素)分别于20m L的带盖刻度试管中，加水至15m L。各管加0.5m L冰醋酸，混匀。加30 g/L高锰酸钾溶液0.5m L，混匀，放置2min，使氧化去杂质。滴加3%双氧水溶液数滴，直至高锰酸钾的颜色退掉，剧烈震摇此管，使多余的氧气逸出。
(3)核黄素的吸附和洗脱
核黄素吸附柱: 称硅镁吸附剂约1g，用湿法装柱，占柱长1/2～2/3(约5cm)为宜，吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上，勿使柱内产生气泡，调节流速约为60滴/min。
过柱与洗脱: 将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后，用约20m L热水洗去样液中的杂质。然后用5.00m L洗脱液将试样中核黄素洗脱并收集于一支带盖10m L刻度试管中，再用水洗吸附柱，收集洗出之液并定容至10m L，混匀后待测荧光。
(4)标准曲线的制备
分别精确吸取核黄素标准使用液0.3m L，0.6m L，0.9m L，1.25m L，2.5m L，5.0m L， 10.0m L，20.0m L(相当于0.3μg，0.6μg，0.9μg，1.25μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg， 20.0μg核黄素)或取与试样含量相近的单点标准按核黄素的吸附和洗脱步骤操作。
(5)测定
于激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量试样管及标准管的荧光值。
待试样及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液(5～7m L)中加0.1m L20%低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20秒内测定各管的荧光值，作试样的空白值和标准的空白值。
5)结果计算
式中: X——试样中含核黄素的量，mg/100g;
A——试样管荧光值;
B——试样管空白荧光值;
C——标准管荧光值;
D——标准管空白管荧光值;
f——稀释倍数;
m——样品的质量，g;
S——标准管中核黄素的含量，μg;
100/1000——将样品中核黄素量由μg/g折算成mg/100g的折算系数。
6)说明及注意事项
①该方法的检出限为0.006μg，线性范围为0.1～20μg。
②核黄素对光敏感，整个操作应在避光条件下进行。
③核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型，但摇动后很快被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。
④试样提取液中若有色素，可吸收部分荧光，因此要除去色素(用高锰酸钾氧化)。
⑤在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
2.微生物法
1)原理
某一种微生物的生长(繁殖)必需某些维生素，例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，简称L．C．)生长需要核黄素，培养基中若缺乏这种维生素该细菌就不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况，以及它的代谢产物乳酸的浓度和培养基中该维生素含量成正比，因此可以用测定酸度及混浊度的方法来测定试样中核黄素的含量。
2)试剂
①盐酸(0.1mol/L)。
②冰乙酸。
③氢氧化钠溶液(1mol/L和0.1mol/L)。
④氯化钠溶液(生理盐水，0.9g/L): 使用前应进行灭菌处理。
⑤无水乙酸钠。
⑥氢氧化铵。
⑦甲苯。
⑧干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei ATCC7469)。
⑨乙酸铅。
⑩核黄素标准储备液(25μg/m L): 配制同荧光法。
核黄素标准使用液(0.1μg/m L): 准确吸取1.0m L中间液于100m L容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液。
碱处理蛋白胨: 分别称取40g蛋白胨和20g氢氧化钠于250m L水中。混合后，放于37℃±0.5℃恒温箱内，24～48h后取出，用冰乙酸调节p H值至6.8，加14g无水乙酸钠(或23.2g含有3分子结晶水的乙酸钠)，稀释至800m L，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。
胱氨酸溶液(1g/L): 称取1g L-胱氨酸于小烧杯中。加20m L水，缓慢加入5～10 m L盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至1L，加少许甲苯盖于溶液表面。
酵母补充液: 称取100g酵母提取物干粉于500m L水中，称取150g乙酸铅于500m L水中，将两溶液混合，以氢氧化铵调节p H至酚酞呈红色(取少许溶液检验)。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节p H值至6.5。通入硫化氢直至不生沉淀，过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。
甲盐溶液: 称取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至500m L。加入少许甲苯以保存之。
乙盐溶液:称取10g硫酸镁(Mg SO4·7H2O)，0.5g硫酸亚铁(Fe SO4·7H2O)和0.5g硫酸锰(Mn SO4·4H2O)，加水溶解，并稀释至500m L，加少许甲苯以保存之。
碱处理蛋白胨 100m L
0.1%胱氨酸溶液 100m L
酵母补充液 20m L
甲盐溶液 10m L
乙盐溶液 10m L
无水葡萄糖 10g
无水葡萄糖 1g
乙酸钠(Na Ac·3H2O) 1.7g
蛋白胨 0.8g
酵母提取物干粉 0.2g
甲盐溶液 0.2m L
乙盐溶液 0.2m L
琼脂 1.2g
溴甲酚绿指示剂(0.4g/L): 称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4m L0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研磨，直至完全溶解。用水稀释至250m L。
3)仪器与设备
①电热恒温培养箱。
②离心沉淀机。
③液体快速混合器。
④高压消毒锅。
4)菌种的制备与保存
(1)储备菌种的制备
以L．C．纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中。在37℃±0.5℃恒温培养箱中保温16～24h。贮于冰箱内，至多不超过2周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续2～3天方可使用，否则生长不好。
(2)种子培养液的制备
取5m L核黄素标准使用液和5m L基本培养储备液于15m L离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在6.9×104Pa压力下灭菌15min。每次可制备2～4管。
5)操作步骤
(1)接种液的制备
使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中，同时制做两管。在37℃±0.5℃保温16～24h。取出后离心10min(3000r/min)，以无菌操作方法倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗二次，再加10m L消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已消毒的注射器内，立即使用。
(2)试样的制备
将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。称取约含5～10μg的核黄素样品(谷类约10g，干豆类约4g，肉类约5g)，加入50m L0.1mol/L盐酸溶液，混匀。置于高压锅内，在1.03×105Pa压力下水解30min。冷至室温，用1mol/L氢氧化钠溶液调节p H至4.6(取少许水解液，用溴甲酚绿检验，溶液呈草绿色即可)。加入淀粉酶或木瓜蛋白酶，每克样品加入20mg酶。在40℃恒温箱中过夜，大约16h。冷至室温，加水稀释到100m L，过滤。对于脂肪量高的食物，可用乙醚提取，以除去脂肪。
(3)标准管的制备
在三组试管中每管各加核黄素标准使用液0.0m L，0.5m L，1.0m L，1.5m L，2.0m L， 2.5m L，3.0m L，每管加水至5m L，再每管加5m L基本培养储备液混匀。
(4)试样管的制备
吸取试样溶液5～10m L，置于25m L具塞试管中，用0.1mol/L氢氧化钠调节p H值至6.8(取少许溶液，用溴麝香草酚蓝检验)，加水稀释至刻度。取两组试管，各加试样稀释液1 m L，2m L，3m L，4m L，每管加水至5m L，每管再加5m L基本培养储备液混匀。
(5)灭菌
将以上样品管和标准管全部塞上棉塞，置于高压锅内，在6.9×104Pa压力下灭菌15min。
(6)接种和培养
待试管冷至室温，在无菌操作条件下接种，每管加一滴接种液，接种时注射器针头不要碰试管壁，要使接种液直接滴在培养液内。
置于37℃±0.5℃恒温箱中培养约72h，培养时每管必须在同一温度。培养时间可延长18h或减少12h。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混浊度测定法，以培养18～24h为宜。
(7)滴定
将试管中培养液倒入50m L三角瓶中，加0.01g/L溴麝香草酚蓝溶液5m L，分二次淋洗试管，洗液倒至该三角瓶中，以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，终点呈绿色。以第一瓶的滴定终点作为变色参照瓶。约30min后再换一参照瓶，因溶液放置过久颜色变浅。
(8)标准曲线的绘制
用标准核黄素溶液的不同浓度为横坐标及在滴定时所需0.1mol/L氢氧化钠的毫升数为纵坐标，绘制标准曲线。
6)结果计算
式中: X——试样中核黄素含量，mg/100g;
c——以曲线查得每毫升试样中核黄素含量，μg/m L;
V——试样水解液定容总体积，m L;
f——试样液的稀释倍数;
m——试样质量，g;
100/1000——试样含量由微克每克(μg/g)换算成毫克每一百克(mg/100g)的换算系数。
7)说明及注意事项
①日光和紫外线对核黄素有破坏作用，所以一切操作要在暗室内进行。
②在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。
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