食品中菌落总数的测定

实训23　食品中菌落总数的测定

一、实训目的

（1）学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理。

（2）了解菌落总数测定在对被检样品进行卫生学评价中的意义。

二、实训原理

菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得1g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。

三、实训器材

1．器具

灭菌的锥形瓶，试管，培养皿，玻璃涂布棒，接种环，接种针，纱布，吸量管。

2．试剂

1mol／L　NaOH溶液，1mol／L　HCl溶液，磷酸盐缓冲溶液，无菌生理盐水。

3．培养基

平板计数琼脂培养基。

四、实训步骤

1．样品的稀释及接种

1）检样稀释

用香皂或肥皂将手及胳膊洗干净。将装有225mL稀释液的锥形瓶、装有9mL稀释液的试管（放在试管架上）、吸量管、洗耳球等放在超净工作台上。用75%的酒精将手及胳膊在超净工作台内消毒。将无菌培养基、灭菌的培养皿、灭菌的涂布棒放在超净工作台上。

固体和半固体样品：称取25g样品，在超净工作台上置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000～10000r／min均质1～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成10^－1稀释度的样品匀液。

液体样品：在超净工作台上，于酒精灯火焰附近以无菌吸量管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成10^－1稀释度的样品匀液。

在超净工作台上，用1mL无菌吸量管或微量移液器吸取10^－1样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸量管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸量管反复吹打使其混合均匀，制成10－2稀释度的样品匀液。

按1∶9的比例，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸量管或吸头。如果对样品污染状况不了解，一般准备10^－8稀释度的稀释样品匀液。

2）接种

在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌培养皿内作空白对照。

将熔化并冷却至46℃（可于（46±1）℃恒温水浴锅中保温）的平板计数琼脂培养基倾注于灭菌培养皿内。倒平板时，先用右手握住锥形瓶的底部，倾斜锥形瓶，随之将瓶口周缘在酒精灯火焰上灭菌，用左手旋松棉塞，小指和手掌边缘夹住棉塞并拔出（切勿将棉塞放在桌面上），硅胶塞用左手打开并倒放在工作台上，封口膜扣放在操作台上。左手拿起一套培养皿，用中指、无名指和小指托住培养皿底部，用食指和大拇指夹住皿盖并开启一缝，恰好能让锥形瓶瓶口伸入，随后缓缓倒入培养基，以铺满皿底为度，在台面上顺时针、逆时针各转三圈，使之混合均匀，然后将皿盖斜盖在皿底上，并微留缝隙，放置15min左右，使培养基凝固。工作结束后，用消毒液擦拭超净工作台面，关闭照明电源，重新开启紫外灯照射15min后断开电源。

2．培养

将倒置平板放于恒温箱中（36±1）℃培养（48±2）h。水产品（30±1）℃培养（72±3）h。

如果样品中有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，再继续培养。

3．菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。

（1）选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的记为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

（3）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

五、结果记录

1．菌落总数的计算方法

详见模块二下项目2．1的任务6。

2．菌落总数的报告

（1）菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

（2）菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

（5）称重取样以CFU／g为单位报告，体积取样以CFU／mL为单位报告。

六、思考题

（1）食品中菌落总数是怎样测定的？

（2）怎样正确报告菌落总数的结果？