结核分枝杆菌的形态和结构

一、结核分枝杆菌基本形态

结核分枝杆菌经萋尔－尼尔逊染色（Ziehl－Neelson，Z－N，简称萋－尼染色），在生物显微镜（1 000×）下观察，发现不同种的分枝杆菌形态变化各异，呈略弯曲或直的两端钝圆的杆菌，多数为杆状、稍弯曲；单个排列，或偶呈串珠颗粒状，菌体宽度0．3～0．6μm；菌体长度不一，在0．5～8μm，多数在1．5～3μm；牛型分枝杆菌则比较粗短，少数菌体较长者可呈螺旋状；染色良好的结核分枝杆菌菌体内，能够发现着色较深的异染颗粒。金胺O染色后的分枝杆菌在暗的背景下呈现明亮的黄色，颜色明亮的分枝杆菌与暗背景之间具有极大的视觉反差，便于大面积扫描观看分枝杆菌。多数非结核分枝杆菌（non－tuberculosis mycobacteria，NTM）的形态较结核分枝杆菌短且粗，呈棒状、短棒状，甚至颗粒状。

分枝杆菌在大多数培养基上，菌落粗糙、凸起、致密、有表面皱褶和薄的不规则边缘。菌落质地脆，色泽为黄白、浅黄、黄色，无可溶性色素。在液体培养基培养时，在培养基底部和表面膜样生长方式。表面薄膜白色，继续培养逐渐加厚，皱褶，呈淡黄色。有毒株在液体培养基中可呈索状生长。在吐温80培养基中可分散均匀生长。但在含微量琼脂的半流体培养基中，显现在试管中部单个致密菌团样生长。临床野生株，特别是化疗后菌落常有不典型的菌落形态，以及生长贫瘠、缓慢、湿润等表型异质性改变。培养生长的菌落经生理盐水研磨、悬浮物稀释后涂片镜检，结核分枝杆菌的形态较标本直接涂片的稍短且粗，常聚集而形成“索状”，经培养的非结核分枝杆菌菌体形态与临床标本相比变化不大，且较少聚集。

在发现结核杆菌是结核病病原菌后不久，人们就发现了结核分枝杆菌的形态多样性。在患病淋巴结中观察到了颗粒样、球状等各种大小、各种排列的多形态现象。因此，与其他微生物一样，由于菌株、菌龄等发育和生长环境条件的不同，结核分枝杆菌存在形态的多样性，特别是化疗增加了形态多样性出现的机会。

（一）结核分枝杆菌的形态

结核分枝杆菌不仅有上述典型形态，还有细长状、丝状、短链状、球形状、颗粒状等多种形态。这是由于生长环境的变化、营养条件的变化，并在抗结核药物的作用和机体免疫功能的影响下，细菌为保持自身功能和生存及对环境的适应性而产生的。

结核分枝杆菌（MTB）菌体具有多形态特征，其各种形态可归纳为杆菌型（基本形态）、颗粒型、球菌型（L型）、滤过型四种类型。

1．杆菌型（基本形态） MTB正常典型的形态是直的或是稍弯曲、两端钝圆的杆菌。无芽胞、无荚膜、无鞭毛，生长发育期间有分支生长倾向。经抗酸染色菌体呈红色杆状，单个散在或呈人形、V形、T形、Y形排列，菌体多时细菌扭集在一起呈绳索状、束状或丛状，菌体堆积一团时类似“菊花冠”状杆菌团。

2．颗粒型 1908年，Much（莫赫）在结核性脓肿、浆液性渗出液、淋巴结和痰标本中检出到革兰染色阳性颗粒，称为莫赫颗粒。一般认为，莫赫颗粒为非抗酸性非细胞型体，但有感染豚鼠并发育成正常杆菌的能力。至于颗粒型是个体发育阶段或是环境的适应均未得到深入的研究。

3．球菌型（L型） 球菌型体是结核分枝杆菌在内外环境（免疫、营养、药物）的作用下，使细菌在发育生长过程中呈现的一种变异的菌体形态。细菌之所以呈现球菌型体是由于维持细菌固有形态的细胞壁内某些成分的缺损或丧失。依据细胞壁的某些成分缺损程度呈现形态大小不一的球菌型体。L型细菌就是球菌型之一。

1935年，Lister医学研究院的Kleneberger在研究念珠状链杆菌时发现一种生长极小的菌落，检查中观察到细菌呈现多形态，有线状体及膨大的球形体，被命名L型细菌。张世馥等于1994年报道，在对结核性淋巴结炎的病理切片中观察到L型细菌。

L型细菌细胞壁的缺损，致细菌形态、生化、生理、毒力与病理等生物学方面均与亲代菌株不同，反映在临床病理组织学上的不典型结核结节，临床体征上的非特征型表现。

L型细菌在机体的存活，具有潜在的危害性，当机体免疫功能低下时，细菌复活发育繁殖，返祖为亲代细菌的毒力，使结核病恶化与进展。有资料报道骨关节结核病灶中存在L型细菌。

4．滤过型 早在1901年，就发现结核病患者的临床材料存在可通过细菌滤膜的颗粒。1991年，Khoomenkov在豚鼠损坏性肺结核模型中证实了滤过型的存在。经化疗后，虽未能由豚鼠组织中分离培养出结核分枝杆菌，但电镜检查发现空洞壁上存在可通过细菌滤膜的超小型菌体，体积约为正常细菌的1／20，具有电子致密的外壳和很低的蛋白含量，可在宿主组织中长期存在。液体培养基中培养后出现球状体，可染色检出。病变滤液连续数次通过动物后，可在动物脏器组织中分离得到典型的结核分枝杆菌。

对结核分枝杆菌多形态的认识，特别是非杆菌型的存在与否，对结核病诊断、治疗和预防有很大的关系。但是，异型结核分枝杆菌是否确切存在，其产生的机制、可信的检出和鉴定，以及与临床结核病关系的本质阐明，这些都关系到“菌阴”结核病的诊断、疗效和痊愈标准的判定、化疗方案的评价等一系列临床结核病关键问题的认识，仍有待明确可信的阐明。因此，目前临床细菌学检查中仍以典型的杆菌形态为依据。

（二）结核分枝杆菌的细微结构

由于分枝杆菌细胞结构和细胞成分的特殊性，具有经碱性染料染色后能够耐受酸性介质脱色的特征，具备相应染色特征的细菌习惯上被称为抗酸菌（acid－fast bacillus，AFB）。目前，除结核分枝杆菌（临床上最常见的分枝杆菌）外发现的分枝杆菌种类已有100余种。当然，除分枝杆菌外还有少数细菌具有抗酸染色特征。

1．抗酸菌菌体细胞结构的完整性与其抗酸染色特性有着密切联系 通过电子显微镜观察分枝杆菌，完整的细胞结构主要有以下部分组成。

（1）细胞壁：分内、中、外三层，外层细胞壁的主要成分为分枝菌酸，是分枝杆菌细胞抗酸染色特征的主要成分；中层细胞壁的主要成分有肽脂糖和磷脂蛋白；内层细胞壁的主要成分是多糖体。分枝杆菌细胞壁的组成和结构的完整性，对相应细菌的抗酸染色特性起到关键作用。

（2）细胞膜：主要由脂蛋白组成。部分细胞膜通过折叠、卷曲，能够形成层状结构，被称为中介体（或间体）的细胞器。

（3）细胞质：基本成分是水、蛋白质、核酸、脂质以及少数的糖类和无机盐类。

（4）核区：由DNA和参与遗传表达的RNA密集而形成。

（5）细胞器：主要成分为三酰甘油、抗酸脱色能力较差的脂质空泡和主要成分是聚磷酸盐、具有极强抗酸脱色性的异染小体（异染颗粒）等。

2．在电子显微镜下观察菌体超薄切片可见其微细结构 结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质组成。

（1）细胞壁：结核分枝杆菌细胞壁厚度约20nm，具有较强的坚韧性和弹性，从而保护和维持细菌的固有形态。细胞壁的坚韧性与其化学结构上肽聚糖等特定性组成成分直接相关。结核分枝杆菌胞壁含有丰富的脂质，约占细胞壁的60%，丰富的脂质胞壁结构赋予结核分枝杆菌抗酸染色性、通透性、表面抗原性、毒力等一系列相关性状。

电镜下可观察到结核分枝杆菌细胞壁由三层组成，即内、外电子密度层和中间的电子透明层。细胞壁内层包裹在质膜外，由肽葡聚糖和二氨基庚二酸的肽聚糖组成的胞壁质构成。多糖链交错位置上含N－糖基胞壁酸和乙酰葡糖胺，交链肽是由L－丙氨酸、D－异谷氨酰胺、内消旋二氨基庚二酸组成的小肽。中间较宽的电子透明层是由脂阿拉伯半乳聚糖分枝菌酸构成，阿拉伯半乳聚糖内端和内层肽聚糖相连，其阿拉伯糖共价连接到分枝菌酸为末端的长脂肪酸链上，形成致密的网状结构，细胞壁的刚性和细菌形态，也是苯胺染料着色的部位。最外层是电子不透明胞膜层，厚度变化较大，由分枝菌糖苷脂（mycoside）为末端的肽聚糖脂（peptidoglycolipid）组成。脂阿拉伯甘露聚糖是磷脂酰基多糖，锚定在质膜上穿过整个胞壁，伸展在胞壁表面。

（2）细胞膜：细胞膜位于细胞壁内层，是围绕于细胞质外的一层具有柔软性和富于弹性的半透膜，主要成分是脂类蛋白质，脂类物质构成细胞膜的脂质双分子层，蛋白质镶嵌在液态的脂质双层内和附着在脂质双层的内表面上，同时膜上含有许多酶类。在结核分枝杆菌与外界环境进行物质交换和引起细菌细胞内一系列的代谢活动中起重要作用。

（3）细胞质：细胞质是带黏滞性的液体，充满了细胞膜内的整个空间。其中可见大小不同，多少不等的颗粒。核糖体是游离于细胞质的小颗粒，每一菌细胞内含有核糖体的数目有数万之多，是合成蛋白质的重要物质。核糖体化学成分70%为RNA，30%为蛋白质。在菌细胞内约有90%RNA和40%蛋白质存在于核糖体内。在mRNA作用下，核糖体进一步合成蛋白质。细胞质内还含有多种颗粒，颗粒内含有多糖、脂类、无机盐类等成分，是营养储存的场所。颗粒大小与多少，在不同环境和不同生长发育期不尽相同。在营养物质充足的培养条件下，胞质内颗粒增多，营养缺乏时，颗粒减少或消失，这可能是由于细胞储藏的营养物质或代谢不同所致。细胞质是细胞合成蛋白质和RNA生命活性物质的场所，也是细菌对营养物质进行同化作用和异化作用的场所。细胞质内不含内质网与线粒体等结构。细胞质内的中介体（简体）是一种膜样构造，由细胞膜向胞质内凹陷折叠而形成。在中介体膜上含有许多酶类系统，如琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、三羧酸腺苷酶、酸性磷酸酶等，因此中介体与细菌呼吸、分裂、染色体的复制与分配上有密切关系。

（4）核质：核质有单一双股DNA或染色体组成，是遗传物质基础。在电子显微镜下可见由极细的纤维状物质组成，与细胞质不分开，无核膜，也无核仁。一个菌细胞内一般有1～2个核质，多位于菌体内的中部。核分裂先于细胞分裂，菌细胞的分裂、核的复制为简单分裂，而不是有丝分裂。

二、结核分枝杆菌菌体的化学成分

（一）脂质

脂质是结核分枝杆菌的重要组成成分，细胞壁内含量最高，约占细胞壁干重的60%。一般认为脂质含量与细菌毒力有关，结核分枝杆菌脂质含量最高，而毒力较弱的牛分枝杆菌含量较少。脂质主要包括磷脂、脂肪酸和蜡质等成分，多与蛋白质和多糖以结合形式存在。

1．分枝菌酸是Stodol于1938年分离得到的具有分支的高分子长链α－烷基－β－羟基脂肪酸。鉴于分枝从属于主链故应采用分枝菌酸的译名。分枝菌酸及其衍生物是分枝杆菌属所共有，其碳链长度为28～40的碳原子。在相关的棒状杆菌属和诺卡菌属中也存在各自的分枝菌酸，但是它们的碳原子数不同，可作为属鉴别的依据。这些分枝菌酸均具有抗酸着色性，但随着它们碳链的延长，抗酸着色性减弱。

2．酰化海藻糖包括海藻糖双分枝菌酸酯和硫苷脂。海藻糖－6，6′－双分枝菌酸酯是1977年从牛型分枝杆菌中分离得到的。海藻糖双分支菌酸酯在胞壁中是和阿拉伯半乳聚糖结合存在或独立存在尚无定论。海藻糖双分枝菌酸具有介导肉芽肿形成、诱导巨噬细胞释放细胞趋化因子的作用。

（二）脂多糖

1．肽分枝菌酸阿拉伯半乳聚糖（mAGP）是分枝杆菌细胞壁的最大的Ⅳ型肽聚糖。肽聚糖是氨基酸和氨基糖的聚合物，由大量二氨基庚二酸连接分枝菌酸阿拉伯半乳聚糖组成胞壁的电子透明胞壁中层，占据了胞壁的主要部分。氨基肽聚葡糖构成电子密度内层。内层肽聚糖通过磷酸脂双键共价连接在中层的分枝菌酸阿拉伯半乳聚糖的阿拉伯聚糖上。

2．脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）：是分枝杆菌细胞壁上第二个多糖分子，是分支多糖链，锚定在质膜磷脂上，穿过整个细胞壁，向胞外方向延伸至胞壁表面，是分枝杆菌的显性抗原性分子。LAM是一种中性多糖，由D－甘露吡喃糖骨架组成，有酰化和非酰化两型。LAM是分枝杆菌属各种共同具有的分子。

（三）核酸（DNA和RNA）

1．DNA是具有遗传功能的核酸分子，因其特定的双螺旋结构、碱基堆积力和氢键决定了其稳定性。与其他细菌一样，分枝杆菌基因组是由简单的共价封闭环DNA链组成。富含G＋C是分枝杆菌基因组构成的共同特点，大多数分枝杆菌的G＋C含量为64%～70%，结核分枝杆菌复合群为65%左右。Athwal于1989年指出，结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌）内DNA杂交同源性为78%～98%，形成一个高度同源性的复合群。它们与快速生长分枝杆菌的同源性为4%～26%，但与同为缓慢生长的麻风分枝杆菌的同源性仅为1%。

2．RNA。参与细胞基因表达过程的RNA主要有三大类，即核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）和信使RNA（mRNA）。rRNA与许多不同的蛋白质结合形成核糖体，提供蛋白质合成中所有相互作用的分子所必需的结合部位。rRNA在总RNA分子中含量丰富（75%～80%），在原核生物中多拷贝存在。结核分枝杆菌的rRNA有近4 000拷贝。由23S rRNA和16SrRNA组成，16SrRNA是更为保守的序列，其序列微小的变异反映了种系发生上的相关性，可作为分枝杆菌种的鉴定（ribotype）依据。一般情况下，tRNA占细胞总RNA的15%左右，主要功能是将特异的氨基酸运送至核糖体，参与多肽的合成。tRNA反密码子和mRNA密码子碱基互补，使mRNA携带的遗传信息和一定的氨基酸相对应。在细菌中，rRNA和tRNA可能是连续形成的，由于它们对核酸酶的抵抗力大于mRNA，可在细胞中存留。mRNA分子种类多，分子量大小不一，在细胞中含量少1%～5%。mRNA是依赖于DNA的RNA聚合酶转录的产物，传递DNA信息，指导蛋白质的合成。编码不同蛋白质的不同mRNA在结核分枝杆菌细胞内的确切拷贝数仍不清楚。原核生物mRNA的半衰期很短，仅2～3min。