第九章 结核分枝杆菌的遗传学
近十余年来，分子遗传学方法已逐步应用于分枝杆菌的研究。例如，能穿梭克隆DN A于大肠埃希菌和分枝杆菌之间的质粒和噬菌体已得到发展，并已在免疫原性蛋白质、抗生素耐药性、毒力和分枝酸生物合成途径等方面获得了重要的信息。插入序列亦已分离，并已应用于结核分枝杆菌的诊断、菌株分型和突变发生的研究。功能性启动子也已确定，并已应用于产生表达异种抗原的重组分枝杆菌。这些研究成果构成了现代分子微生物学和现代结核病学的基础，也为了解结核病的发病机制提供极为有意义的资料。
一、分类学
通过核糖体RN A（r RN A）序列的比较得知，分枝杆菌是一种高鸟嘌呤＋胞嘧啶（G＋C）含量的革兰阳性细菌。分枝杆菌的GC含量在58%（麻风分枝杆菌）至69%（细胞内分枝杆菌）之间。结核分枝杆菌H37Rv菌株的DN A中GC含量为65%。DN A组成间的明显差异致使分枝杆菌的基因与低GC含量细菌（如大肠埃希菌）的同源性基因之间很少能发生DN A交叉杂交。但在高GC含量的藤黄微球菌（Micrococcus luteus）和结核分枝杆菌的基因之间则可发生交叉杂交。同源性大肠埃希菌基因产物的蛋白质序列高度保守。因此，适用于分枝杆菌中的，以高GC含量密码子设计的寡核苷酸探针，可以在聚合酶链反应（PCR）扩增过程中扩增结核分枝杆菌中的同源性基因。
比较性的DNA杂交在检测极为相关菌种之间的关系时较之rRNA序列更为敏感。滤膜杂交实验证实，结核分枝杆菌、牛型分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌共同形成彼此之间有77%～95% DN A同源性的密切聚集群体。其他分枝杆菌菌属则与结核分枝杆菌有1%～48%的同源性，如常用于基因传递实验中的快速生长细菌，耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌仅有4.3%的同源性；麻风分枝杆菌与结核分枝杆菌之间由滤膜杂交所检定的核酸同源性亦仅1%。
二、基因组结构
结核分枝杆菌基因组的大小为2.5×109 bp，由光学检定的重缔合动力学所确定的碱基对（bp）共有3.8×106个，结核分枝杆菌的重缔合动力学与大肠埃希菌K12相同，但与这两菌属GC含量间的差异无关。近年使用高分子量DN A分离技术脉冲凝胶电泳（PFGE）直接测定大肠埃希菌K12基因组的大小，并可构成由4.7×106 bp DN A所组成的物理图。应用该技术于结核分枝杆菌基因组的研究时，细菌的基因组DN A以PFGE分离、限制性内切酶Dra消化，发现DN A条带大小的总和约为3.2×106 bp。在进行PFGE时，由重缔合动力学和物理分离法所测定基因组大小间的一些差异，可能是由于在重缔合分析时缺少对GC含量的校正所致。因为尚无法构建结核分枝杆菌存有的基因图，故目前大规模基因组结构的研究多寄托于物理方法，如PFGE作图和将大型DNA的邻近片段克隆至黏粒（cosmid）等方法。在用集中于特异操纵子的较小规模基因组作图中，物理方法可以显示数种分枝杆菌rRNA位点的结构。如同所有已研究的真细菌一样，分枝杆菌也有3种rRNA存在于操纵子之中，其中16S rRNA位于5′端；23SrRNA居中；5SrRNA则位于3′端。
缓慢生长的结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌仅有1个拷贝rRNA操纵子，这与有7个拷贝rRNA（rRnA－G）的大肠埃希菌是根本不同的。快速生长的耻垢分枝杆菌和草分枝杆菌则有2个拷贝的rRNA操纵子。可见在分枝杆菌中，rRNA拷贝数与生长速度相关。与分枝杆菌无关的支原体也只有1个拷贝的rRNA，其生长也是缓慢的。
结核分枝杆菌中的单一拷贝rRNA是高频率氨基糖苷耐药性发生的一种解释。16S rRNA中的点突变可导致链霉素耐药性的发生。大肠埃希菌中16SrRNA突变是隐性的，而且只有每个16SrRNA基因均发生突变时方可产生高水平的耐药性。多个无关的突变引起的耐药性是极为少见的。结核分枝杆菌则与之不同，链霉素耐药性点突变是显性的，常产生一步骤的高水平耐药性。自发性链霉素耐药性的发生频率为1/106。大约与DNA复制时所发生的点突变机会相同。
分枝杆菌的高GC含量是由于其密码子中G或C的较强偏倚所致。这一结论是在检查了结核分枝杆菌的克隆蛋白质序列和分支噬菌体L5的全部序列后而取得的。对于氨基酸资料已知的克隆基因序列的分析包括2 619个密码子，而且由85个推断的蛋白编码基因中含有15 339个可能的密码子的L5序列显示，标准的遗传密码均用于结核分枝杆菌。因此，如有适当的转录和转译信号包含于蛋白编码序列存在时，分枝杆菌的基因也可在其他细菌内产生功能性蛋白质。低GC含量细菌的基因在适当的表达载体中转染至分枝杆菌时，亦可产生蛋白质。
三、调节性基因元件
对于能调节特异分枝杆菌蛋白水平的DNA和RNA元件的鉴定，在了解这一细菌的代谢和构建能表达异体基因的重组分枝杆菌方面是必需的。现已克隆和测序了几种蛋白编码基因和rRNA基因。早期通过互补大肠埃希菌营养缺陷型于分枝杆菌DNA文库的企图已告失败，从而产生这样的结论，认为蛋白质表达机制不能识别分枝杆菌的调节性元件。以后直接评估是否在牛型分枝杆菌中有DNA元件可以作为大肠埃希菌中的启动子，即在无启动子的氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因面前随机克隆分枝杆菌的DNA，并检测大肠埃希菌中的氯酶素耐药性。结果发现有2%来源于牛型分枝杆菌的构建物可导致500μg/ml的氯酶素耐药性。这表明有一小部分牛型分枝杆菌启动子能在大肠埃希菌中起作用。在大肠埃希菌中提供高水平氯酶素耐药性的牛型分枝杆菌DNA，能产生高水平的CAT蛋白。
以后的结核分枝杆菌蛋白质克隆化则用能生成β－半乳糖苷酶融合蛋白的大肠埃希菌表达载体来进行。分枝杆菌DNA文库则用由分枝杆菌抗原所产生的单克隆抗体进行试验。很多以此种方式克隆出的免疫优势抗原都与在原核细胞和真核细胞中所发现的热休克蛋白（HSP）同源。如对这些基因的上游部分进行分析，则可发现有与大肠埃希菌具有密切同源性的调节性元件存在。来源于结核分枝杆菌的HSP分子量65×103基因启动子可以驱动大肠埃希菌中的蛋白质形成。BCG中HSP分子量60×103基因的引物延伸已毫无疑问地证实了在自然条件下由热休克所诱导的功能性操纵子的存在。这种启动子可以作为异种抗原在结核分枝杆菌复合体中表达的基础。
对于r RN A操纵子上游部分的序列亦已进行了分析，也如同在HSP基因中的情况一样。与大肠埃希菌调节元件的密切同源性同样存在。即有－35和－10启动子元件、抗终止区、RN A酶Ⅲ处理信号以及16S r RN A内的3′端区域。这一区域与m RN A中转译起始位点前4～10个核苷酸的区域互补。16S r RN A和mRN A互补的区域称为Shine－Dalgarno序列，它可决定引导核糖体至正确的起始密码子。结核分枝杆菌和大肠埃希菌有相同的共有Shine－Dalgarno序列，这在比较这两菌属的16S r RN A和5′端未转译m RN A序列时，即可得到证明。关于蛋白质产生所必需的主要DN A元件已在分枝杆菌中已获鉴定的结论，受到一些实验观察结果的支持，如利用这些调节性元件的表达载体能在转染的分枝杆菌中产生高水平的克隆蛋白质。
四、噬菌体
分枝噬菌体是感染分枝杆菌的病毒，有头部和尾部。病毒基因组包含于其蛋白质的外壳（衣壳）内。由于其衣壳中含有结构类脂，故有些分枝噬菌体可被有机溶剂灭活。分枝噬菌体T M4，L1和L5的双链基因组的大小约为5×104 bp，而D29噬菌体为4.8×104 bp；I8噬菌体为4.3×104 bp。当噬菌体以其尾部顶端吸附至特异的细胞受体，并注入其双链DN A分子至宿主细胞内后，噬菌体即可在细胞内生长。
（一）噬菌体的生活周期
噬菌体DN A经过受体介导的噬菌体吸附后即可注入细菌。噬菌体DN A既可稳定地整合至细菌的染色体上而形成溶原状态（lysogeny），也可立即进行DN A复制，开始溶解感染过程。噬菌体在溶原状态下可以无限期地继续被细菌带上，成为细菌染色体的一部分，或者在紫外光照射的诱导下开始噬菌体DN A复制。并向细菌溶解方向发展。噬菌体DN A复制后，即可有噬菌体蛋白质合成，并装配产生结构组成。噬菌体DN A包被于脂蛋白的头部内。在极少情况下，细菌DN A也被包被于噬菌体头部。噬菌体装配完成后，细菌裂解，释出有感染性的颗粒。带有细菌DN A的噬菌体可将基因由一个细菌转导至另一细菌。
（二）噬菌体在基因传导中的作用
噬菌体感染可在复制周期终止时通过细胞裂解而使其死亡，或者通过将病毒DN A整合至细菌染色体成为原噬菌体（prophage），而使病毒与细菌长期结合，构成溶原状态。有时亦可产生假溶原状态或带毒状态，此时噬菌体与细菌长期结合而不分离。高频率感染力和溶原状态时整合至细菌染色体的能力方可使分支噬菌体能够用作为基因传导实验中的载体。
能引起细菌裂解的噬菌体称为毒力噬菌体，而能整合至细菌染色体者则称为温和噬菌体。在生产性感染中，注入的DN A决定各种基因产物的合成，这些产物能促进噬菌体DN A的自主复制和衣壳形成中结构蛋白的合成。核酸和蛋白质进行装配，形成病毒颗粒，然后通过细胞裂解由细胞中释出。
在噬菌体的另一复制方式中，注入的噬菌体DNA插入细菌染色体而成为原噬菌体。带有原噬菌体的细菌成为溶原菌（lysogen），它能将产生噬菌体颗粒的能力传递于其子代。为了保证溶原性途径得以形成，注入的DNA必须首先指导那些能促进插入细菌染色体的基因产物合成，同时抑制噬菌体DNA的自主复制和裂解功能。已经整合的原噬菌体可以和细菌染色体一道复制，或因诱导而从细菌染色体上释出，从而产生增殖性繁殖。原噬菌体的诱导自发地出现，或在体外因紫外光的作用而发生。因为只有温和噬菌体才能维持溶原性感染，故在基因传递实验中多使用温和噬菌体。
（三）分支噬菌体
在大肠埃希菌λ噬菌体系统中，基因cI编码的转录阻抑物在调节其本身的合成时，能抑制那些控制裂解基因表达的启动子。原噬菌体在无阻抑物功能时进入增殖周期，在此周期中发生原噬菌体由细菌染色体上释出、自主性DNA复制、噬菌体包装和产生以及细胞裂解。分支噬菌体L5的溶原状态也证实受控于基因71（gp71）编码的类似阻抑物蛋白，这种基因是维持溶原状态所必需的。L1溶原状态的建立和维持已证实应借助于编码L1阻抑物的cI基因。
λ噬菌体的cI阻抑物能抑制重复感染的基因。因此溶原性细菌可因有同源性噬菌体而对重复感染有免疫力之故。L5的gp71产物也对L5的重复感染提供免疫力。同样，温和噬菌体的噬斑表现较为混浊。这使由于溶原性细菌对裂解性感染免疫之故。
细菌基因可在感染周期时整合至噬菌体，并可因而转移至另一细菌，这一过程称为转导（transduction）。由于毒力噬菌体必然使细菌裂解，故转导必须要用温和噬菌体来进行。曾有人报告将分支噬菌体L3的腺嘌呤、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸和组氨酸标记转导至耻垢分枝杆菌营养缺陷型突变体。此外也证实此噬菌体能转导对异烟肼（INH）耐药性和易感性的缺定簇和对链霉素的耐药性。也有人报告耻垢分枝杆菌链霉素耐药性的转导。
噬菌体本身的存在可使细菌发生3种改变或修饰，或称为噬菌体转变（phage conversion）：①新特性的导入表明基因在噬菌体基因组内的表达。②原噬菌体插入细菌染色体能改变细菌的遗传功能。此种情况与转座（transposition）中的插入性诱变相似。例如，阻抑基因可在噬菌体插入的部位被灭活或被破坏，导致酶活性的脱阻抑。③噬菌体感染可引起个别细菌和菌落的表型改变，如菌落由粗糙型变为光滑型。
（四）分支噬菌体的应用
与大肠埃希菌λ噬菌体系统一样，分支噬菌体的广泛分子生物学研究不但丰富了对于分枝噬菌体与其宿主间基因调节的了解，而且也为构建基于噬菌体的载体以供有效的基因传递提供有用的工具。Jacob等应用称之为穿梭质粒（shuttle plasmid）的大肠埃希菌－分枝杆菌穿梭载体在分枝杆菌中进行有效的基因传递。这些载体是分支噬菌体DNA和大肠埃希菌黏粒的嵌合体，此种黏粒含有在识别λ特异性包装蛋白时所必需的λ黏性末端位点（cos位点）。这些大肠埃希菌－分枝杆菌穿梭黏粒可以作为裂解性或溶原性噬菌体在分枝杆菌中繁殖；也可作为黏粒在大肠埃希菌中繁殖。第1代穿梭黏粒phAE1的构建是将含有cos位点的大肠埃希菌复制子（replicon）pHC79插入由鸟分枝杆菌中分离的温和噬菌体TM4基因组中的非重要区域而形成的。
通过对分枝噬菌体D29缺失突变株的分析得以鉴定出D29基因组中的两个可供插入异种基因和构建黏粒的非重要区域。含有cos位点的嵌合体DN A能在体外包装至λ噬菌体内。这些重组λ噬菌体颗粒已被转导至大肠埃希菌，在此可作为黏粒而复制。所形成的共价闭和环状质粒DN A以后即可用以转染耻垢分枝杆菌，形成重组噬斑。ph AE1衍生的噬菌体如同其亲代噬菌体T M4一样，可感染3个不同的BCG疫苗菌株，并可在其中复制。T M4虽可使鸟分枝杆菌溶原化，但在耻垢分枝杆菌和BCG中并未形成稳定的T M4溶原菌。
为了克服溶原性不稳定的问题，一般多用温和分枝噬菌体L1。这是因为噬菌体L1在耻垢分枝杆菌的溶原化时，可能通过噬菌体与细菌附着部位间的位点特异性重组而稳定地整合至分枝杆菌的染色体。用与T M4质粒ph AE1生成相似的方式，已形成了能使分枝杆菌溶原化的L1衍生穿梭质粒。L1穿梭质粒ph AE1可使分枝杆菌成为溶原菌，形成耻垢分枝杆菌中的混浊噬斑。第2个L1质粒ph A E19是将决定卡那霉素耐药性的基因插入ph A E15黏粒载体中的特殊克隆部位而生成的，具有使耻垢分枝杆菌溶原化，并形成卡那酶素耐药性菌落的能力。这是异种基因在分枝杆菌中成功表达的一例。
黏粒载体中的特殊克隆部位亦可用于克隆其他异种基因。但是，由于分枝噬菌体大小要求符合λ黏粒包装机制，克隆至这些穿梭质粒中的异种DN A的大小必须限制在（2～4）×103 bp范围以内。分枝噬菌体Ms6可用作为决定卡那酶素耐药性的转座子Tn5中aph基因的运载体，使此种基因稳定地整合至耻垢分枝杆菌的基因组。在转导时，Aph基因能在无正向选择的情况下维持150代。
L5是第1个全部序列得到确定的温和分枝噬菌体。与其他使用宿主的聚合酶进行DN A复制的温和噬菌体不同，L5能编码其本身的聚合酶。此外，L5也能在其溶解性生长时终止宿主的蛋白质合成。有关L5分支噬菌体的两项重要应用为：①整合－熟练载体的构建；②应用L5基因gp71作为基因转化时的选择标记。
稳定溶原体的形成取决于L5附着位点（att P）和染色体附着位点（att B）间的重组，其中att B可受到噬菌体编码的整合酶（int）蛋白和一新的分枝杆菌编码的整合宿主因子的催化。int基因和L5的att P位点以及耻垢分枝杆菌中att B位点的鉴定，可以成功地构建一种质粒载体，这种质粒载体能通过将质粒导入细菌基因组的稳定位点特异性整合，有效地转化快速生长的耻垢分枝杆菌。这些整合－熟练质粒也能有效地转化缓慢生长的分枝杆菌，如结核分枝杆菌和BCG，生成不需要持续的选择作用即可发生的稳定的重组体。后一特性在构建能诱发长期免疫应答的重组BCG疫苗时尤为重要。
L5在耻垢分枝杆菌中形成稳定的溶原体，且其宿主范围较广，包括结核分枝杆菌、BCG以及鸟分枝杆菌的一些菌株。L5基因gp71的基因产物类似阻抑物蛋白GP71在维持溶原状态上是必需的，并可作为噬菌体阻抑物而起作用，gp71也可通过阻止L5及有关的重复感染噬菌体（如D29）对溶原菌的再感染而对重复感染有免疫力。因为溶解性的噬菌体感染产生透明的噬斑，故后者可以作为染色体外和整合性表达载体转化的选择系统；这些载体带有能提供对L5或D29溶解性噬菌体的重复感染免疫的基因gp71。此种新型的选择系统很重要，因为它提供了一种新的方法，可在活BCG重组疫苗的制备时避免应用抗生素耐药性基因。在此情况下应用抗生素耐药基因时，有可能将对药物耐受性的基因扩散至致病菌。
噬菌体基因系统已可成功地应用于分枝杆菌基因、异种抗原和报道基因的克隆和表达。这些都是结核分枝杆菌感染快速诊断和应用BCG构建多价疫苗上的重要应用。此外，应用一基因融合穿梭质粒即可克隆分支噬菌体的表达信号，此种穿梭质粒含有缺少启动子、核糖体结合位点和ATG起始密码子的截短大肠埃希菌LacZ（β－半乳糖苷酶）基因。成功的分枝噬菌体DNA转录和转译启动信号的克隆必将导致β－半乳糖苷酶融合蛋白的表达，并可用显色底物检出，为深入分析分枝杆菌中的调节元件提供有用的研究系统。
最后，还有人试图用噬菌体来治疗豚鼠中的结核分枝杆菌感染和地鼠中的BCG感染。虽然这些早期研究均已宣告无效，但亦可为新的噬菌体治疗提供方向。因为噬菌体感染易于高效地进行，质粒是一种传递自杀基因至结核分枝杆菌的理想载体。为了保证高水平的表达和在病毒感染的早期细胞杀灭，自杀基因必须置于在正常情况下能促进早期病毒基因表达的强分支噬菌体表达信号的控制之下。
五、质粒
（一）质粒的特征
质粒是一种环状、染色体外的自身复制DNA。在自然条件下，质粒可通过接合（conjugation）由一个细菌传递至另一细菌。接合是一种接触介导的现象。但在体外质粒能由于转染而成为裸露DNA，在分枝杆菌中的这一过程需要有电穿孔（electroporation）的严格条件。质粒中常含有一些有利于其宿主细胞的基因，如耐药性基因，故可作为细菌中基因传递的载体。
（二）分枝杆菌中的质粒
在结核分枝杆菌中尚无可信的证据可资说明有质粒的存在。但在其他分枝杆菌中则有许多质粒存在的实例。瘰疬分枝杆菌中的一大型质粒中带有汞还原酶。含有质粒的瘰疬分枝杆菌菌株可以在为汞严重污染的环境内分离到。在此情况下，质粒编码的酶可使瘰疬分枝杆菌通过对环境中汞的脱毒而得以生存。
研究最为广泛的分枝杆菌质粒为偶发分枝杆菌中的pAL5000，这种含有4 837bp的质粒已经得到测序，并证实含有65%的GC。它共有5个开放读框（ORF）和一具有DNA复制起始点特征的区域。通过插入诱变证实，ORF 3和4在质粒的维持上并不需要，但ORF 1和2则是pAL5000在分枝杆菌中增殖所必需的。
偶发分枝杆菌质粒衍生来源的DNA复制也在其他分枝杆菌中起作用，维持结核分枝杆菌复合体和耻垢分枝杆菌中质粒的自主性复制。将偶发分枝杆菌复制起点连结至含有大肠埃希菌DNA复制起点和卡那霉素耐药性的大肠埃希菌DNA，即可构建成大肠埃希菌－分枝杆菌穿梭载体pYUB。此种载体可用以转染耻垢分枝杆菌。初步实验表明其转染率较低，只有少数亲代耻垢分枝杆菌能进行有效的转染。转染效率上的变异提示质粒的稳定性在分枝杆菌中受到调节。高效转染与维持质粒的能力有关，而与限制修饰系统或细胞壁对DNA的不透性无关。因此，很有可能尚有其他可调节分枝杆菌作为质粒宿主的系统存在。
大肠埃希菌－分枝杆菌穿梭载体在大肠埃希菌和分枝杆菌中都能复制，也包括结核分枝杆菌。这种质粒能提供对大肠埃希菌和分枝杆菌的卡那霉速耐药性，表明这种转座子耐药性基因在两类菌属中都能起作用。p U YB所携带的卡那霉素耐药性可使摄取了质粒DN A的细菌发生正向选择。正向选择和复制能力的联合作用能构建一种文库，在此文库中分枝杆菌的DN A片段已被插入p Y UB之类的质粒之中。此种文库可用以筛选大肠埃希菌或分枝杆菌的有关序列或功能，而且可将基因再次插入结核分枝杆菌。
近年来发展了应用BCG热休克蛋白基因Hsp 60的启动子和5′端编码序列的表达载体，如p M V261和p M V361。这些载体含有一些信号，这些信号能启动可为分枝杆菌RN A聚合酶及核糖体识别的调节元件的高水平表达。在Hsp 60调节元件的下游有一多克隆位点和转录终止子（terminator）。表达载体p M V261维持于染色体外，而p M V361则是利用分支噬菌体L5的attP和int整合至染色体中的特异位点，并且不需要与抗生速的持续性选择。这些载体在克隆分枝杆菌基因和产生重组分枝杆菌上极为有用。
质粒在超越较大进化距离的基因信息的传递上有很大的潜在力，这在通过接合将氨基糖苷和磺胺类药物的耐药性由大肠埃希菌传递至耻垢分枝杆菌的工作上得到证实。由革兰阴性细菌传递药物耐药性至耻垢分枝杆菌的效率为每一受体的10－3～10－2。这些研究并证明，药物耐药性基因表达所需的调节信号在革兰阴性细菌和分枝杆菌中同样起作用。
六、转座作用
转座DN A元件开始时被描述为“跳动元件”，因其可进入和离开染色体中的某一区域。这一元件广泛地分布于原核细胞和真核细胞，而且具有很大的理论和实际重要性。有两种类性的转座子：仅编码转座作用所需酶类的插入序列（IS元件）和带有所摄取基因（如DN A编码的药物耐药性酶类基因）的复合转座子（Tn元件）。转座子可通过在编码区域内插入而破坏基因，或者通过提供外来的启动子而活化基因，因而成为进化中的主要媒介。复合转座子尚可移动基因，使其由染色体上移入诸如噬菌体和质粒之类的载体。基因一旦存在于载体，就可广泛地扩散，甚至可由原核细胞扩散至真核细胞。
由结核分枝杆菌复合体中可以分离出3种IS元件，即IS6110，IS1081和ISmyco。这些转座子的大小在968～1 361 bp之间。这三者在其末段均有反向重复序列，其大小有所不同，长度在15～28 bp，并含有1或2个ORF。IS1081或ISmyco的转座子数目和基因组位置无变化。
研究最为广泛的转座子为IS6110，这一转座子可在结核分枝杆菌复合体内发现，而在其他分枝杆菌中则尚未发现。它可发生较少的转座作用。所有的结核分枝杆菌分离菌株，包括从由1 000年以前的木乃伊中肉芽肿中提取的DN A都含有IS6110。只有4例由东南亚分离的结核分枝杆菌中无这种IS元件存在。IS6110的广泛分布和其多态性使其能作为临床结核分枝杆菌分离物限制性片段长度多态性（RFLP）分型的工具。因为IS611对于结核分枝杆菌DN A的存在与否是敏感而且特异的，故可作为PCR法的检测对象以快速诊断感染的存在。
转座子的一项重要实验应用为用其产生诸如毒力之类基因决定的表型突变。应用IS元件以检测分枝杆菌基因组的优点是，一旦某一基因已被转座作用破坏，同时亦可继之以促进克隆的转座子。耻垢分枝杆菌衍生的转座子IS1096可通过基因工程方法使其决定卡那霉素的耐药性，其构建物已用于BCG突变文库的构建。由这一文库衍生的氨基酸营养缺陷型可在体内应用于小鼠感染。初步报告表明，BCG的亮氨酸营养缺陷型不再具有毒力。
在结核分枝杆菌中并无天然存在的Tn元件，但偶发分枝杆菌中则含有决定磺胺类药物耐药性的复合转座子IS610。卡那霉素耐药性基因插入Tn610后，即可用以构建耻垢分枝杆菌中的突变文库。这一过程产生了含有30 000个插入突变株的文库，其中可分离出15种营养缺陷表型。如此大小的突变文库在检测代谢途径个时极为有用。
七、药物耐药性的遗传学
能在多种分枝杆菌中复制并表达选择性标记的质粒，在研究结核分枝杆菌耐药性遗传学时极为有用。近年来有关利福平、INH和链霉素耐药性的分子机制有所报告。
利福平通过与RpoB基因编码的RNA聚合酶β－亚单位结合而抑制分枝杆菌中的mRNA产生。RpoB中的突变基因可因抑制利福平与RNA聚合酶的结合而产生大肠埃希菌中的一步骤耐药性。66株利福平耐药结核分枝杆菌临床分离物的序列分析证实，64株在RpoB中有点突变。含有与利福平耐药性突变有关的克隆RpoB基因当其转染至对药物敏感的耻垢分枝杆菌中时，能使转化体成为耐药菌株。这一转染实验证实，在临床细菌分离物中的突变是耐药性产生的原因。
INH尚可抑制结核分枝杆菌中分枝酸的生物合成。此外，多年来即已得知INH耐药性与结核分枝杆菌的低水平触酶相关，提示INH对酶的修饰在耐药性的形成上也是必需的。为了证实这点，用能提供对触酶缺陷性耻垢分枝杆菌以INH敏感性的能力来克隆结核分枝杆菌的触酶。能提供INH敏感性克隆的转染能使转化体中的触酶活性增加。提供INH敏感性的序列与大肠埃希菌氢过氧化物酶Ⅰ同源，并称之为katG。当katG再次插入结核分枝杆菌缺失突变株时，INH敏感性又可恢复。这就证明katG缺失是决定INH耐药性的一种基因型。但只有25%的INH耐药性临床细菌分离物缺少触酶，提示尚有其他的突变亦可引起INH耐药性。
另有一个决定INH耐药性的基因是转染一个DNA穿梭黏粒文库而分离出的，这一文库是由INH敏感的耻垢分枝杆菌至耐药的耻垢分枝杆菌而制成的，然后再筛选INH耐药性。分离出一种与大肠埃希菌基因有同源性的基因inhA，这种基因并与脂肪酸的生物合成有关。inhA与已知的与脂肪酸生物合成有关的酶有同源性的事实支持INH抑制分枝酸代谢的理论。inhA编码区域内的点突变或天然基因的过度表达，都可引起耐药性。突变的inhA也可导致另一结构相关抗结核药物乙硫异烟胺（ethionamide）的耐药性。综上所述提示，inhA是INH和乙硫异烟胺的分子作用靶。突变影响调节或inhA结构的临床意义迫使要求进行有关临床细菌分离物中inhA突变类型和频率的研究。很有可能在临床分离物中发现有INH耐药性的其他基因型。
氨基糖苷抗生素链霉素对分枝杆菌是杀菌性的，这是因为它能与核糖体结合，并可破坏蛋白质的合成。大肠埃希菌中链霉素耐药性的两个主要机制：一为获得了能灭活药物的酶类；二为能阻止结合的核糖体组分的突变。在结核分枝杆菌的临床分离物中已发现有转座子和质粒中常带有的氨基糖苷修饰酶存在。但是这些酶能在结核分枝杆菌中起作用，因为实验构建的具有氨基糖苷磷酸转移酶的穿梭质粒能决定牛型分枝杆菌和结核分枝杆菌的氨基糖苷耐药性。
在大肠埃希菌中，16S r RN A和S12核糖体蛋白中的点突变产生链霉素耐药性。38株结核分枝杆菌分离菌株中的29株中也观察到相似的点突变，提示核糖体组分的突变也是氨基糖苷耐药性的主要机制。因为结核分枝杆菌只有1个拷贝的核糖体操纵子，这些突变将是显性的。如果将突变的核糖体组分转染至分枝杆菌，则能够产生耐药菌株，故可证实16S r RN A和S12蛋白的突变能引起链霉素耐药性。
很有可能，有关结核分枝杆菌的耐药性机制还将有更多的报道。例如，多种耐药表型可涉及通透性孔道的丧失或者获得了在革兰阴性细菌中所见的药物外流泵（drug effux pumps）。由于包围分枝杆菌的较厚类脂细胞壁的不通透性，所以这些情况可能也是存在的。
就目前的观察而言，作用于药物靶和代谢靶的染色体突变较之通过质粒获得新的酶类更为重要。在结核分枝杆菌的耐药性中，突变的速度和DN A修复的保真性特别重要。解决这一问题的第1步是结核分枝杆菌Rec A的克隆化。这一基因是所有细菌DN A重组和修复过程的中心。仅发现于结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌的Rec A蛋白的不寻常之处是有多肽的转译后剪接，从而产生两个分开的蛋白质。蛋白质Rec A是在剪接了未经处理蛋白质的两端后而形成。剪接后释出的多肽中部成为一内切酶。
八、结论
分子遗传学在有关结核分枝杆菌研究中的应用，使在对于耐药性和抗原组成等现象的了解上有了迅速的进展。如果能持续地利用这一途径在结核病中进行研究，则必将在细胞内寄生菌与其哺乳动物宿主相互作用的基本理论上获得更多的信息。对于分枝杆菌潜伏状态的了解将导致更为有效化学疗法的施行。应用重组BCG作为疫苗进行免疫接种必将为人类造福。
（余传霖）
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