环境样品微生物活性的测定

四、环境样品微生物活性的测定

在环境微生物研究中已发展出许多原位活性测定方法，但在实验室测定环境样品的微生物活性仍然是监测微生物在实际生态环境中活性的重要方法。微生物活性测定可用来估计基本的微生物群实际的或潜在的微生物活性水平，以及自然和人为可变参数的对其活性的影响。微生物活性被广泛用于评价生态系统的健康程度，评估微生物过程(如污水处理、堆肥等过程)的反应速率。

现代微生物学的特征是纯培养，纯培养的活性测定使我们能测出在给定条件下微生物所能达到的最高活性水平，而环境样品的活性测定是纯培养测定的进一步发展。二种类型的活性测定从本质上是一致的，但又有差异。在不同条件下二种活性测定都在环境微生物研究中得到广泛的应用。

图15-3　亚硝酸盐氧化菌的分离程序

1.纯培养微生物活性测定

纯培养微生物的活性实际上是生长过程活性程度的表征。一般生理上的好氧微生物的生长过程可表达为:

基质+氮+磷+→─末端电子受体细胞质量+CO₂+水

从这个方程中可以看出，测定微生物活性有几种方法，包括基质消减、末端电子受体利用、生物量产生和CO₂释放。

基质消减(substrate disappearance):是测定微生物所利用基质消减的程度，对异养活性主要测定碳基质，如测定芳香族化合物的消减可以说明特定菌株降解这种化合物的活性;对化能自养活性则是测定作用基质，如氨氧化成亚硝酸和硝酸盐的硝化作用则通过测定氨氮和亚硝态氨的消减来验证。

末端电子受体(terminal electron acceptors，TEA)利用:各种末端电子受体都可被微生物有效利用，微生物活性水平可反映在TEA消减及还原性TEA的产生上。测定体系中氧的消耗是最常用的指示活性的方法，广泛使用的BOD测定就是建立在O₂的消耗测定上。

细胞生物量(cell mass)增加:细胞生物量的增加是微生物生长活性的直接指标。纯培养中细胞生物量增加的计数方法有直接的显微镜计数、间接的平板计数以及测定培养物的浑浊度或蛋白质含量。通过测定细胞悬浮液的浑浊度，可以快速测定细胞量，一般用比色法或分光光度计来测定浑浊度。蛋白质含量和细胞生物量成正相关，测定蛋白质含量可以推算细胞生物量。

CO₂的释放(carbon dioxide evolution):CO₂释放可以用于好氧和厌氧矿化作用的测定。碱性吸收剂(通常是NaOH或另一种强碱性溶液)可以用来吸收矿化过程产生的CO₂。碱溶液吸收CO₂后将其转化成HCO－3，然后用滴定法测定。利用14C标记的基质，测定释放的¹⁴CO₂是最科学的方法，因为这时产生的14CO₂是源于实际加入的有机碳化物。

2.环境样品微生物活性的测定

环境样品的活性测定不同于纯培养，其更加集中在代谢活性的定量上，如呼吸作用或细胞大分子的合成，这些测定更加直接地反映样品的代谢活性水平。环境样品活性的测定方法可分为四种不同的类型:①碳呼吸;②放射性标记物掺入细胞大分子;③腺苷能荷(AEC);④酶活性分析。

(1)碳呼吸

碳呼吸(carbon respiration)是指微生物在好氧、厌氧条件下利用有机碳基质作为碳源和能源的过程。环境样品中的这种微生物活性可以通过测定TEA消耗量或CO₂释放量来检测。碳呼吸过程中形成的生物量会因不同种类的微生物、不同的利用基质、不同的环境条件而有不同，实际上微生物活性的绝对值不能确定，但测定呼吸气体的流量可以提供微生物活性的相对水平。

1)实验室和野外研究中呼吸作用气体(CO₂和O₂)的测定。许多纯培养条件下使用的测定CO₂和TEA的方法也适用于环境样品。土壤或地下物质中微生物活性测定可以在实验室受控条件或原位(野外)条件下进行。实验室研究多采用微宇宙(microcosm)方法，微宇宙实际上是一个模拟野外条件的微生境。野外原位研究一般是建立一个野外室(field chamber)，用这个装置进行原位测定。一般来说原位研究可以得到比微宇宙更可靠的测定结果。

水环境中微生物活性也可以以氧的消耗来说明，但要考虑水体中的营养物水平、光合作用生物的影响以及各类生物之间相互作用的影响。一般测定工作在短时间内完成，同时对结果的解释也要谨慎。

2)呼吸测定在环境微生物学中的应用。呼吸测定在环境微生物学中的主要应用包括土壤样品中微生物活性的基础速率、基质诱导的微生物活性、微生物生物量、生化需氧量等方面的测定。测定土壤样品中微生物活性的基础速率可以预示特定位点通过呼吸作用显示出的微生物活性。此外还可以作为土壤健康的指示物。测定基质诱导的微生物活性可以评估有机污染物(如石油烃)对微生物群体的影响，例如在受石油烃污染的现场，我们预计微生物会利用这些烃作为一种碳源。这种利用可以通过原位呼吸相对于土著微生物群体呼吸所增加的尺度来测定。微生物生物量可以指示土壤条件和微生物潜力。以碳呼吸为基础的测定微生物生物量的方法有二种，其一是以生物量作为有机碳基质的氯仿熏蒸-培养法，即先以氯仿杀死样品中的微生物，再接种微生物利用这部分有机碳，矿化产生的CO₂即为生物量的量值。计算公式为:

式中，生物量(C)为被综合到微生物生物量中的C量;Fc为熏蒸样品产生的CO₂; UFc为未熏蒸样品产生的CO₂，Kc为生物量C矿化为CO₂的比例。文献中Kc值范围为0.41～0.45。其二是基质诱导呼吸法(substrate-induced respiration method)。把容易分解的有机碳源葡萄糖加到土壤中，这样土壤中所有的微生物的活性都被激发出来，通过测定最初的呼吸反应来测定活的、非休眠异养细胞所含有的C量。培养时间限制在几小时以内，最低的和通常最初的葡萄糖呼吸速率被用作土壤样品中出现的微生物生物量的指示物。生化需氧量(BOD)是表征有机碳化物含量的重要指标，这也被称为BOD物质。BOD的测定也是碳呼吸测定的明显应用例证。

呼吸测定还可指示生态系统中不同微生境的代谢状态。例如用微电极可以测定生物膜表面和内部的呼吸情况。可以发现生物膜的较上层中的大量细菌对氧的快速利用造成了其较深层中的厌氧环境，这样就支持了NO^－

3的厌氧呼吸。

3)厌氧呼吸指示的微生物活性。厌氧呼吸也可以指示厌氧微生物在厌氧条件下的微生物活性。厌氧呼吸包括以NO^-₃、Fe³⁺(和其他金属)、SO^－

4和CO₂作为末端电子受体。对于这些受体中的某些物质来说，形成的气态的中间或最终产物，可以用来测定厌氧呼吸。例如N₂O是细菌转化NO^－

3到N₂(反硝化作用)的中间产物。乙炔常常用于抑制NO^－

3的完全反硝化，而导致N₂O积累。样品中用乙炔处理而产生的N₂O与反硝化率成比例。

(2)放射性标记示踪物掺入细胞大分子

许多异养细菌可以从环境中吸收已形成的分子(如核苷酸或氨基酸)合成生物大分子。这种生物大分子的生物合成是微生物生长活性的重要指示物。监测放射性核苷酸或氨基酸掺入主要细胞大分子的速率是测定微生物活性的一种方法。被用作示踪剂的特殊分子的例子是胸腺嘧啶核苷酸和氨基酸的亮氨酸，前者用³H标记，被掺入到DNA中，后者用氚或¹⁴C标记，其掺入到蛋白质。

胸腺嘧啶掺入DNA速率的测定方法一般是将〔³H〕胸腺嘧啶加入到含有浮游细菌的水样或者水与土壤或沉积物相混合而形成的泥浆中。培养时间通常限制在几个小时，标记胸腺嘧啶向细胞的掺入过程用加入的化学抑制剂或被置于冰浴中来中止反应。然后，DNA从细胞中被提取出来，并经放射活性计数来确定已经掺入的标记物的数量，从而可以计算出掺入率，掺入率再经转换成微生物活性。

亮氨酸掺入蛋白质测定微生物活性可以应用同样的方法，大多数细菌从周围环境中吸收亮氨酸且大部分同化的放射性活性标记物将被掺入到蛋白质中。

(3)腺苷酸能荷

ATP是细胞中能量储存和转化的一种方式。ATP含量变化取决于细胞的活性水平，快速生长的细胞有着比受压迫细胞更高的ATP含量。从测定微生物活性的角度，ATP相对于其前体ADP和AMP的相对丰富度可以说明高能态(ATP)能否快速形成。ATP/ADP/AMP的比值可以提供估测微生物生物体生理状况、营养状况的生化基础。腺苷酸能荷(adenylate energy charge，AEC)比值测定的是细胞腺苷酸的重量比:

高AEC值(＞0.8)反映一个活跃群落，中间值(0.4～0.8)反映细胞的休眠状态，低值(＜0.4)反映死亡或垂死细胞的比率大。AEC已被用于描述土壤和地下环境中微生物的活性。此外，对于特定土壤条件下的土壤样品，ATP与细胞生物量之间存在一个恒定的关系。总腺苷酸(ATP、ADP、AMP)的检测可以提供一个更好的微生物生物量的指示物。

(4)酶分析

微生物的一切生理生化过程都离不开酶，监测催化反应过程中的酶活性是监测微生物活性的重要基础。已发展出一种多酶分析方法(表15-4)，前面几种测定的是一般的微生物活性，后面几种用于特定的活性测定。最常用的是脱氢酶分析(dehydrogenase assay)、酯酶分析。

表15-4　　用于测定微生物活性的一般和特殊酶分析

引自微生物生态学:基础与应用(第三版)。

脱氢酶是胞内酶，能催化有机化合物呼吸作用所需要的氧化-还原反应。因为脱氢酶处在胞外时就失去活性，所以这种分析被认为是微生物活性的一种测定法。脱氢酶反应可以用水溶性几乎无色的四唑盐来检测。反应体系中盐被还原形成微红色甲替(formazan)产物，这种产物可被萃取测定。

酯酶分析也能反映环境样品中一般或总的微生物活性。这种分析是以荧光素乙二酸酯(FDA)的水解为基础的。FDA能被多种酶水解，包括酯酶、蛋白酶和脂肪酶。水解产物高荧光分子荧光素可溶于水并可用荧光计或分光光度计检测。一般在缓冲溶液中用FDA培养环境样品几分钟到几小时，离心收集上清液，定量测定产生的荧光素，从而可以评估微生物的活性。此外FDA水解产物与生物量测定也有很好的相关性，因而可以说明微生物的生物量。

环境样品微生物活性的测定是一个十分复杂的问题，研究者要根据不同的研究目标与目的选择最合适的方法(表15-5)。

表15-5　　测定环境样品微生物活性的几种常用方法

续表

注:这个表意味着强调了这些技术的优缺点，但是还不全面。