补体总活性测定

时间：2022-05-11 理论教育版权反馈

【摘要】：血清补体总活性的测定，是针对激活后补体最终效应的检测方法，可借此反映补体系统的功能。已建立的补体总活性测定方法，都是以红细胞的溶解为指示，以50％溶血为判断终点，故称为CH50。特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，引起红细胞肿胀而发生溶血。溶血程度与补体的活性相关，但两者并非直线关系。当红细胞量一定时，在规定反应时间内，溶血程度与血清中参与旁路激活的补体量及活性呈正相关。

一、补体总活性测定

血清补体总活性的测定，是针对激活后补体最终效应的检测方法，可借此反映补体系统的功能。已建立的补体总活性测定方法，都是以红细胞的溶解为指示，以50％溶血为判断终点，故称为CH50（50％ complement hemolysis）。已应用于科研和临床的方法包括：基于经典途径的CP-CH50（常表示为CH50）和旁路途径AP-CH50（常表示为AP50）的检测，其中CH50是临床常规进行的补体总活性检测项目。

（一）补体经典途径溶血活性（CH50）测定

【原理】

特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，引起红细胞肿胀而发生溶血。溶血程度与补体的活性相关，但两者并非直线关系。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线（图7-1）。以溶血百分率为纵坐标，相应血清量（即补体量）为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血时，对补体量的变换不敏感。S形曲线在30％～70％之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，就会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。因此，实验时常以50％溶血作为终点指标，更为敏感。

图7-1　溶血程度与补体含量的关系

【试剂与器材】

1.缓冲盐水（pH值7.4）

（1）贮备液　NaCl75 g、1 mol/L HCl 177 mL、三乙醇胺28 mL、MgCl₂·6H₂O 1.0 g、CaCl₂·2H₂O 0.2 g。先将NaCl溶于700 mL蒸馏水中，加入HCl及三乙醇胺。MgCl₂及CaCl₂分别用2 mL蒸馏水溶解后，逐一缓慢加入，再用蒸馏水加至1000 mL。4℃保存。

（2）应用液　取一份贮备液，加9份蒸馏水，4℃保存备用。

2.2％绵羊红细胞悬液　新鲜脱纤维羊血或Alsever液保存羊血（4℃可存3周），生理盐水洗涤2次。第3次用缓冲液盐水2500 r/min离心10 min。取压积细胞用缓冲液盐水配成2％悬液。为使红细胞浓度标准化，可将2％细胞悬液用缓冲盐水稀释25倍，用分光光度计（542 nm）测定吸光度（以缓冲盐水调零），每次实验用红细胞吸光度必须一致，否则应重新调整。

3.制备2U的溶血素　将抗绵羊红细胞抗体（溶血素）按效价以缓冲盐水稀释至2U，如效价为8000，使用时按1∶4000稀释。

4.分光光度计、水浴箱、离心机、移液管、试管及试管架等。

【操作方法】

1.致敏红细胞　2％绵羊红细胞加等量2U溶血素，混匀，置37℃水浴10 min。

2.稀释血清　取待测血清0.2 mL，加缓冲盐水3.8 mL，稀释度为1∶20。

3.配制50％溶血标准管　取致敏羊红细胞悬液0.5 mL，加入蒸馏水2.0 mL混匀，使其溶血，即为全溶血管；取全溶血管2 mL加缓冲液2 mL，即为50％溶血标准管。

4.加样与反应　按表7-1所示进行加样，第10管为非溶血对照。加样完成后混匀，试管置37℃水浴30 min。

5.离心与比色　将各试管经2 000 r/min离心5 min，对照管应不溶血。先用肉眼比色，选取与50％溶血管相近两管，再用分光光度计（542 nm波长，0.5 cm比色杯）测定吸光度。

表7-1　CH50测定操作步骤

注：CH50U/mL=20/x，x为引起50％溶血的最少血清量，20为待测血清稀释倍数。

【结果判断】

用分光光度计读取吸光度，与50％溶血管最近似的一管为终点管，通过上表即可测出待检血清CH50单位（U/mL），其参考值为50～100 U/mL。

【注意事项】

1.待测血清必须新鲜，不得溶血。

2.缓冲盐水、致敏红细胞均应新鲜配制。夏天宜将试剂在4℃预冷，以稳定补体活性。

3.该试验为筛查试验，CH50降低只能总体反映补体系统活性低下，不能具体提示何种补体成分缺陷。

【临床意义】

该法主要反映补体经典途径的溶血功能，其结果与C1～C9每个组分的量及活性均有关，反映的是9种成分的综合水平，在急性炎症、组织损伤（如风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎和多发性关节炎）、恶性肿瘤等疾病时，常可见补体活性增高。在急性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮活动期、急性乙型病毒肝炎、慢性肝病和遗传性血管神经性水肿等可见补体活性降低。

（二）补体旁路途径溶血活性（AP50）测定

【原理】

未致敏的家兔红细胞可激活血清中的B因子，引起旁路途径活化，导致家兔红细胞溶解。当红细胞量一定时，在规定反应时间内，溶血程度与血清中参与旁路激活的补体量及活性呈正相关。AP50与CH50测定相似，以引起50％溶血所需要的最少补体量作为一个AP50单位，计算出待检血清中补体旁路激活途径的溶血活性，以AP50 kU/L表示。

【试剂与器材】

（1）0.1 mol/L乙二醇双醚四乙酸（EGTA） NaOH 3.5 g，溶于蒸馏水85 mL中，加入EGTA 19 g，溶解后，补足蒸馏水至500 mL。

（2）巴比妥缓冲液原液NaCl 21.5 g，巴比妥1.44 g，巴比妥钠0.94 g，蒸馏水加至500 mL。

（3）稀释液　0.1 mol/L EGTA 80mL，巴比妥缓冲原液180mL，MgCl₂·6H₂O 0.41 g，蒸馏水补足至1 000 mL，以1 mol/L NaOH调pH值至7.5。

（4）0.5％家兔红细胞（RE） RE用Alsever液保存于4℃冰箱内，可用2周。使用前以生理盐水洗涤2次，稀释液洗涤1次（2 000 r/min离心10 min），取压积细胞用缓冲液配成0.5％ RE悬液。

（5）分光光度计、水浴箱、离心机、移液管、试管等。

【操作方法】

（1）稀释血清　将待测血清0.3 mL加稀释液0.9 mL，做1∶4稀释，混匀后置37℃水浴10 min。

（2）配制50％溶血标准管　取0.5％ RE 0.2 mL，加蒸馏水0.8 mL。

（3）加样与反应　按表7-2所示进行加样。加完后混匀，将试管置37℃水浴30 min。

（4）离心与比色　取出试管经2 000 r/min离心5 min，以上清液与50％溶血标准管目视比色或用分光光度计（542 nm波长，0.5 cm比色杯）测定吸光度，与50％溶血管最近似的一管即为终点管。

表7-2　AP50测定操作步骤