总补体活性测定

实验20　总补体活性测定

(The total complement activity assay)

【目的】

掌握总补体活性测定的操作过程、结果判断及补体含量的计算。

【原理】

补体能使溶血素(抗绵羊红细胞抗体)致敏的绵羊红细胞(SRBC)发生溶血，当致敏的绵羊红细胞浓度恒定时，溶血程度与补体含量和活性呈正比例关系。因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反应，测定溶血程度，根据溶血程度判断受检血清中的总补体活性，以50％溶血时的最小血清量为判定终点，可测知补体总溶血活性。

补体溶血实验常用的方法为50％溶血实验，而且50％溶血判断结果要比100％溶血灵敏、准确。即引起50％溶血所需要的最小补体量，以CH50U/ml表示。在观察补体量与溶血百分率关系的试验中，发现两者在坐标纸上呈“S”形曲线关系(图20-1)，但在30％～70％溶血范围内几乎呈直线，在此范围内能敏感地反映补体量的差异，因此以50％溶血判定作为终点，可以提高测定的敏感性。

【材料】

1. 1％致敏SRBC，即溶血素(抗SRBC抗体)致敏的SRBC。

2. 2％绵羊红胞悬液。采用新鲜脱纤维羊血。先将抗凝血液1000r/min离心10min，弃去上清液，加10倍量生理盐水并用毛细管吸吹混匀，1000r/min离心10min，再弃去上清液，如此用生理盐水洗2次，第3次2000r/min 5min，取压积红细胞用缓冲液配成2％绵羊红胞悬液。

(1)为了使2％细胞悬液标准化，吸取0.2ml 2％绵羊红细胞悬液加入5ml缓冲液充分混匀后置光径1cm比色杯中，于分光光度计波长542nm测定其透光率，用缓冲液作空白对照，校正透光率至100％。测定管透光率应为40％，否则应予调整。因红细胞易于下沉，每次应用前需充分摇匀，否则会影响结果的准确性。

(2)自制溶血素:在使用前应先滴定其效价，然后再稀释成2单位溶血素。

(3)致敏绵羊红细胞:按实验所需量取2％绵羊红细胞加等量2单位溶血素，混匀后置37℃水浴10min。

3. 50％溶血标准管配置:

(1) 2％血红素溶液: 2％SRBC10ml加入10ml刻度离心管中，2000r/min离心10min，弃上清液，加蒸馏水至9.5ml处，使其全部溶血，再加0.5ml 17％NaCl缓冲液使之成等渗溶液，并加入少量NaN₃，置冰箱保存备用。

17％NaCl缓冲液配方:

NaCl　　　　　　17g　　

Na₂HPO₄　　　　 1.13g　　

KH₂PO₄　　　　　0.27g　

ddH₂O　　　　　 100ml　　

(2)取2％血红素0.1ml加2％SRBC0.1ml，再加入生理盐水0.8ml，2000r/min离心5min，上清液作为50％溶血标准管，供当天使用。

3.待检血清，或用新鲜豚鼠血清。

4.生理盐水。

5.水浴箱、小试管、吸管等。

【方法】

1.取洁净小试管7支排于试管架上，并标以管号。

2.稀释血清，将待测血清或豚鼠血清用生理盐水做1∶10，1∶20，1∶40稀释。

3.第一管加1∶10血清0.5ml，第2管加1∶20血清0.5ml，3-7管加1∶40血清，加量见下表。

4.每管中加入一定量的生理盐水(表20-1)。

表20-1　CH50测定操作法

5.加1％致敏SRBC，每管0.4ml。

6. 37℃水浴30min。

7. 1000r/min离心5min，与50％溶血标准管比较，判定结果。

【结果】

上述各检测试验管分别与50％溶血标准管以肉眼观察比较。待测血清中的最少量补体仍能产生50％溶血的试验管，为该血清50％溶血的补体含量。补体的含量用下式计算，以单位(U)表示。

本次实验与50％溶血标准管对照后判定为第5管，结果:

【注意事项】

1.待检血清标本应无溶血、无乳糜、无污染。

2.缓冲液、致敏SRBC均应新鲜配制，缓冲液若被细菌污染，会导致自发溶血。

3.待检血清标本必须新鲜，如室温放置2h以上，会使补体活性下降。

4.实验所用玻璃器皿一定要清洁，酸碱均能影响测定的准确性。

5.测定需在0～4℃进行，试管需预冷，可保持补体活性。

图20-1　CH50测定

6.补体的溶血活性与反应体系的pH值、离子强度、钙镁离子量、绵羊红细胞浓度及反应温度、时间等因素均有一定关系。如pH值升高，离子强度增强，使补体的溶血活性下降。红细胞浓度增加，使50％溶血所需的补体量增加。因此，在进行该项试验时对反应的各个环节应严格控制。

【临床意义】

1.患有急性炎症、感染、组织损伤(如风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、伤寒、Reiter综合征和多发性结节炎)、癌肿、骨髓瘤等时，常可见补体含量增高。

2.低补体血症多见于急性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、SLE活动期、RA、亚急性细菌性心内膜炎、急性乙型病毒性肝炎、遗传性血管神经性水肿等。

【思考题】

1.遗传性血管神经性水肿时，患者的血清补体水平为什么会低下?

2.在急性炎症、感染、组织损伤时患者血清补体水平为什么会增高?