血清胆固醇的测定

实验十二　血清胆固醇的测定

【实验目的】

掌握血清中胆固醇测定的原理和方法。

【实验原理】

血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类:一类是化学法，包括抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用;另一类是酶法测定，该方法敏感、特异、快速，并能自动化分析，已常规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。另外，三氯化铁-硫酸反应法(Zak法)具有显色稳定、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法、胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点，缺点是特异性差，干扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸、血清样品中的血红蛋白、胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。

化学法的步骤一般包括:抽提、皂化、毛地黄皂苷沉淀纯化和显色比色四个阶段。Abell-Kendall改良法的基本原理是在血清中加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard显色反应，620 nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取和定量测定。

酶法的原理是首先将血清中的胆固醇酯被胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下，生成△4-胆甾烯酮和H₂O₂，H₂O₂再经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替吡啉(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine，ESPAS)参与下，生成红色醌亚胺色素。

本实验将简单介绍Abell法和酶法测定血清中胆固醇的操作方法。

【实验材料】

人血清。

【实验器材】

试管、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、分光光度计等。

【药品试剂】

1．乙醇、石油醚、冰醋酸、无水醋酸、浓硫酸。

2．33%(W/W)KOH溶液:氢氧化钾10 g溶解在20 ml水中。

3．KOH-乙醇溶液:乙醇94 ml和33%(W/W)KOH溶液6 ml混合。

4．Liebermann Burchard反应液:无水醋酸20 ml，浓硫酸1 ml，冰醋酸10 ml。按照下面的方法进行配置。在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10分钟，又加冰醋酸混匀，备用。

5．17 mmol/L胆固醇标准液:胆固醇标准品200 mg溶于100 ml乙醇中。

6．酶法反应混合液:50 mmol/L Na₂HPO₄，50 mmol/L NaH₂PO₄，3 mmol/L胆酸钠，0．82 mmol/L 4-氨基安替吡啉，14 mmol/L ESPAS，0．17 mmol/L Carbowax-6000，33U/L CEH，117U/L COD，6700U/L POD，混匀，调pH值至6．70±0．10(25℃)，配置好后在24小时内使用(有商品化的试剂购买)。

【实验方法】

1．Abell法:

(1)皂化反应:取三支试管，其中一支为空白对照。在其中一支试管中加入0．2 ml标准胆固醇溶液，另外一支试管中加入0．2 ml血清。向两支试管中加入KOH-乙醇溶液2 ml。振荡均匀后，在37℃水浴锅中保温1小时，之后取出试管平衡到室温。

(2)抽提:向发生反应的两支试管中分别加入5 ml石油醚和2 ml双蒸水，充分混匀后，将试管中的液体转移到50 ml离心管中，在1000 r/min条件下离心5分钟。

(3)分层:将上述两支试管离心后各取出上清液2 ml到干净的试管中，同时在空白对照试管中加入2 ml石油醚。

(4)蒸发干燥:将上面三支试管置于60℃水浴锅中，使石油醚蒸干。之后，分别向三支试管中加入3 ml Liebermann Burchard反应液(L-B反应液)，静置30分钟。

(5)测定:以空白管调零，在620 nm波长下测定两支试管中的吸收值。标准胆固醇测定的值为T，样品测定的值为A。

(6)计算:血清总胆固醇的浓度=A/T×5．17 mmol/L。

2．酶法(CEH、COD-POD法):

(1)准备三支试管，标注为空白管、测定管和标准管。分别向三支试管中加入3ml预热到37℃的酶法混合溶液，混合均匀后在37℃保温10分钟。

(2)在空白管中加入30μl水，在测定管中加入30μl血清，在标准管中加入30μl标准胆固醇溶液，37℃继续保温10分钟。

(3)以空白管调零，在500 nm波长条件下测定标准管(T)和测定管中样品(A)的吸收值。

(4)计算:血清总胆固醇的浓度=A/T×5．17 mmol/L。

【思考题】

1．比较测定血清中胆固醇的两种方法各有什么优缺点。

2．简单叙述化学法和酶法测定血清中胆固醇的原理和操作步骤。