细菌生长繁殖与变异

第二节　细菌生长繁殖与变异

细菌属于原核细胞型微生物，表面积大，代谢旺盛，代谢类型多样，生长繁殖迅速，可产生各种代谢产物。细菌生长繁殖受环境因素影响较大，当环境条件适宜时，细菌生长繁殖迅速，代谢旺盛；当环境条件不利于细菌生长时，细菌生命活动受到抑制甚至死亡。了解细菌生长繁殖的条件、生命活动规律以及代谢产物，有助于对细菌的人工培养、分离鉴定及病原菌的致病性判断，同时，对细菌性疾病的诊断、治疗及预防都有重要的意义。

一、细菌的生长繁殖

（一）细菌生长繁殖的条件

细菌种类繁多，所需要的生长繁殖条件不完全一样，但必须具备下列几个必要条件。

1.营养物质

细菌从周围环境中吸收的作为代谢活动必需的有机物与无机物，称为细菌的营养物质。

（1）水　水是各种生物细胞不可缺少的必要成分，占细菌重量的80%～90%。细菌营养的吸收和渗透、分泌、排泄都以水为媒介，细菌新陈代谢过程中所有的化学反应都必须在有水的条件下才能进行。

（2）碳源　如CO₂、碳酸盐、糖、脂肪等含碳物质能被细菌吸收利用，作为合成菌体所必需的原料，同时也作为细菌代谢的主要能量来源。

（3）氮源　多数病原菌是利用有机氮化物如氨基酸、蛋白胨作为氮源。少数细菌（如固氮菌）能以空气中的游离氮或无机氮如硝酸盐、铵盐等为氮源。

（4）无机盐　钾、钠、钙、镁、硫和磷等是细菌生长代谢中所需的无机盐成分。各类无机盐的作用为：①构成菌体成分；②调节菌体内外渗透压；③促进酶的活性或作为某些辅酶组分；④某些元素与细菌的生长繁殖及致病作用密切相关。

（5）生长因子　很多细菌在其生长过程中还需要一些自身不能合成的生长因子（growth factor）。生长因子必须从外界获得，其中包括维生素、某些氨基酸、脂类、嘌呤、嘧啶等。此外，某些细菌还需要特殊的生长因子，如流感嗜血杆菌需血液中的V、X两种因子。

2.温度

大多数病原菌最适温度为人体的体温，即37℃，故实验室一般采用37℃恒温箱培养细菌。有些病原菌在低温下也可生长繁殖，如鼠疫耶尔森菌最适生长温度为28～30℃。

3.酸碱度

多数病原菌最适pH值为中性或弱碱性（pH为7.2～7.6）。人类血液、组织液pH为7.4，细菌极易生存，但有些组织液如胃液偏酸，绝大多数细菌可被杀死，对人体起保护作用。个别细菌在碱性条件下生长良好，如霍乱弧菌在pH 8.4～9.2时生长最好；也有的细菌最适pH偏酸，如结核分枝杆菌的最适pH为6.5～6.8。

4.气体环境

细菌生长繁殖需要的气体主要是氧气和二氧化碳。根据细菌对氧的需求不同分为四类。

（1）专性需氧菌　必须在有氧的环境中才能生长，如结核分枝杆菌。

（2）微需氧菌　需在低氧压的环境中生长，如幽门螺杆菌和空肠弯曲菌等。

（3）专性厌氧菌　必须在无氧环境中才能生长，如破伤风杆菌和脆弱类杆菌等。

（4）兼性厌氧菌　在有氧及无氧的条件下均能生长繁殖，但有氧时生长更好，大多数病原菌属于此类，如葡萄球菌和伤寒沙门菌等。

（二）细菌繁殖的方式与速度

细菌以二分裂方式无性繁殖，其突出的特点为繁殖速度极快。细菌分裂倍增的必需时间，称为代时（generation time），细菌代时一般为20～30min，个别细菌较慢，如结核分枝杆菌代时为18～20h，梅毒螺旋体代时为33h。

（三）细菌生长繁殖的规律

细菌生长繁殖是有一定规律的，将一定数量的细菌接种适当培养基后，研究细菌生长过程的规律，以培养时间为横坐标，培养物中活菌数的对数为纵坐标，可得出一条反映细菌增殖规律的曲线，称为生长曲线（图8-10）。细菌的生长曲线可分为四期。

图8-10　细菌的生长曲线

注：表示很少或无；表示活细胞；表示死细胞。

1.迟缓期（lag phase）

细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少。细菌主要以体积增大为主，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。

2.对数期（logarithmic phase）

对数期又称指数期（exponential phage），此期活菌数以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等，这时细菌形态、染色、生理活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感。

3.稳定期（stationary phase）

该期由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O₂等）的积累及pH值下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度逐渐下降，细菌死亡数逐渐增加。细菌形态、染色、生理活性可出现改变，并产生相应的代谢产物，如外毒素、内毒素、抗生素，以及芽胞等。

4.衰退期（decline phase）

随着稳定期的进展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辨认其形态。

体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现像培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，有目的地研究和控制病原菌的生长，可发现和培养对人类有用的细菌。

（四）细菌的代谢产物及意义

细菌的新陈代谢包括一系列复杂的生物化学反应，这些反应都是在酶的控制和催化下进行的。细菌的代谢分为分解代谢和合成代谢两个方面。细菌在分解代谢和合成代谢中能产生多种代谢产物，在细菌的鉴定方面具有重要意义。

1.细菌的分解代谢产物及检测

分解代谢是指将复杂的营养物质分解为简单的化合物，为合成菌体成分提供原料的同时，还可获得能量以供代谢所需。不同的细菌具有不同的酶，对糖、蛋白质等的分解能力以及分解后的产物也不相同，可作为鉴定细菌的重要手段。各代谢产物可通过生化试验的方法检测，细菌的生化反应可用于鉴别细菌，对于鉴别形态、革兰染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。例如吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、VP试验（Vi）、枸橼酸盐利用试验（C）四种试验常用于鉴别肠道杆菌，合称IMViC试验。

（1）糖的分解代谢产物及检测　①糖发酵试验：细菌对各种糖的分解能力及代谢产物不同，可借以鉴别细菌。一般非致病菌能发酵多种单糖，如大肠埃希菌能分解葡萄糖和乳糖，生化反应结果为产酸、产气。伤寒沙门菌可分解葡萄糖产酸，但无解氢酶，生化结果为产酸不产气。伤寒沙门菌及一般致病菌大都不能分解乳糖。②VP试验：有些细菌能使丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性溶液中被空气中的氧氧化成双乙酰，双乙酰在α-萘酚和肌酸的催化下，生成红色化合物，为VP试验（voges pros kaner test）阳性。③甲基红试验：产气荚膜杆菌使丙酮酸脱羧后形成中性产物，培养液pH值大于5.4，甲基红指示剂呈橘黄色，为甲基红试验阴性，大肠埃希菌分解葡萄糖产生丙酮酸，培养液呈酸性，pH值小于5.4，指示剂甲基红呈红色，称为甲基红试验阳性。④枸橼酸盐利用试验：能利用枸橼酸盐作为唯一碳源的细菌如产气荚膜杆菌，可分解枸橼酸盐生成碳酸盐，同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，指示剂溴麝香草酚蓝（BTB）由淡绿转为深蓝，此为枸橼酸盐利用试验阳性。

（2）蛋白质的分解代谢产物及检测　①吲哚试验：含有色氨酸酶的细菌（如大肠埃希菌、变形杆菌等）可分解色氨酸生成吲哚，若加入二甲基氨基苯甲醛试剂，形成玫瑰吲哚，呈红色，称为吲哚试验阳性，无色为阴性。主要用于肠道杆菌的鉴定。②硫化氢试验：变形杆菌、乙型副伤寒沙门菌等能分解胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。在有醋酸铅或硫酸亚铁存在时，则生成黑色硫化铅或硫化亚铁，有黑色沉淀者为阳性，无变化者为阴性。

2.细菌的合成代谢产物及临床意义

合成代谢是指将简单的化合物合成复杂的菌体成分或其他物质，同时消耗能量，保证细菌的生长繁殖。细菌通过新陈代谢不断合成菌体成分，如多糖、蛋白质、脂肪和核酸等。此外，细菌还能合成很多在医学上具有重要意义的代谢产物。这些产物有的与致病有关，有的可用于鉴别细菌，有的可用于防治疾病。

（1）热原质　热原质（pyrogen）即菌体中的脂多糖，大多是由革兰阴性菌产生的。进入人或动物体内能引起发热反应，故名热原质。热原质耐高热，高压蒸汽灭菌不能使其破坏，加热（180℃4h，250℃45min，650℃1min）才使其失去生物活性。药液、水等被细菌污染后，即使高压灭菌或经滤过除菌仍可有热原质存在，输注入机体后可引起严重发热反应。目前除去热原质最好的方法是蒸馏。

（2）毒素与侵袭性酶　细菌可产生内、外毒素及侵袭性酶，与细菌的致病性密切相关。内毒素（endotoxin）即革兰阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为脂质A，菌体死亡崩解后释放出来。外毒素（exotoxin）是由革兰阳性菌及少数革兰阴性菌在生长代谢过程中释放至菌体外的蛋白质，具有抗原性强、毒性强等特点。某些细菌可产生具有侵袭性的酶，能损伤机体组织，促进细菌的侵袭、扩散，是细菌重要的致病因素，如金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶、化脓性链球菌产生的透明质酸酶等。

（3）色素（pigment）　有些细菌能产生色素，细菌色素分为水溶性色素和脂溶性色素两类。水溶性色素能扩散到培养基或周围组织，如铜绿假单胞菌产生的绿色色素而使培养基和脓汁呈绿色；脂溶性色素不溶于水，仅保持在菌落内使之呈色而培养基颜色不变，如金黄色葡萄球菌产生的金黄色色素。色素对细菌的鉴别有一定意义。

（4）抗生素（antibiotic）　某些微生物在代谢过程中可产生抑制或杀死其他微生物或癌细胞的物质，称为抗生素。抗生素多由放线菌和真菌产生，细菌仅产生少数几种。抗生素已广泛用于感染性疾病和肿瘤的治疗。

（5）细菌素（bactericin）　某些细菌能产生一种仅作用于近缘细菌的抗菌物质，称为细菌素。细菌素为蛋白类物质，抗菌范围很窄，治疗意义不大，但可用于细菌分型和流行病学调查。

（6）维生素（vitamin）　某些细菌可合成供自身需要的维生素，并能分泌到菌体外，人体可以吸收利用。如人体肠道中的大肠埃希菌能合成B族维生素和维生素K。

（五）细菌的人工培养

细菌的人工培养是指根据细菌生长繁殖的条件及其规律，用人工方法提供细菌必需的培养物质和适宜的生长环境来培养细菌，进行细菌生物学性状的研究、生物制品的制备及传染性疾病的诊断与治疗等。

1.培养基的种类

培养基（culture medium）是人工配制的适合细菌生长繁殖的营养基质。由于各种细菌所需要的营养不同，所以培养基的种类很多。这些培养基可根据所含成分、物理状态，以及不同的使用目的等而分成若干类型。

（1）按照培养基的成分来分

①合成培养基：这种培养基的化学成分清楚，组成成分确定，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢，如蔡氏（Czapek）培养基。

②天然培养基：由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养真菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不稳定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。

③半合成培养基：在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养真菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基等。

（2）按照培养基的物理状态分

①液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂，这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，可用于增菌培养和鉴定细菌种类。

②半固体培养基：在液体培养基中加入0.2%～0.5%的琼脂而成，呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和保存菌种。

③固体培养基：在培养基中加入2%～5%的琼脂即成为固体培养基。常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。

（3）按照培养基用途分

①基础培养基：含有一般细菌生长繁殖所需要的基本营养成分。常用的是肉汤培养基和普通琼脂培养基。其成分包括牛肉膏或牛肉汤、蛋白胨和氯化钠等，用于大多数细菌的培养。

②营养培养基：在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏、动植物组织提取液等营养物质制成，可供营养要求较高的细菌生长。常用的是血琼脂平板。

③选择培养基：根据细菌对化学物质的敏感性不同，在培养基中加入某些化学物质，抑制某些细菌的生长，促进另一类细菌的生长繁殖，选择性地将目的菌分离出来，这类培养基称为选择培养基，如SS琼脂培养基。

④鉴别培养基：以培养和鉴别细菌为目的而配制的培养基称为鉴别培养基。根据各种细菌对糖和蛋白质的分解能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，观察细菌生长后对底物的分解情况，从而鉴别细菌。常用的有各种单糖发酵管、伊红-美蓝琼脂培养基等。

⑤厌氧培养基：专供厌氧菌的分离、培养和鉴别用的培养基称为厌氧培养基。培养基内部为无氧环境，氧化还原电势低，营养丰富。常用的有庖肉培养基、硫乙醇酸盐肉汤培养基等。

2.细菌在培养基中的生长现象

细菌在不同物理性状培养基中的生长现象各异。

（1）细菌在液体培养基中的生长现象：细菌在液体培养基中的可以呈现三种生长现象。①混浊生长：大多数细菌在液体培养基中生长后呈均匀混浊状态，如葡萄球菌。②沉淀生长：少数呈链状生长的细菌在液体培养基中沉淀在试管的底部，如链球菌。③菌膜生长：专性需氧菌对氧气浓度要求比较高，在液体培养基中生长时浮在液体表面生长，形成菌膜，如枯草芽胞杆菌。

（2）细菌在半固体培养基中的生长现象：半固体培养基琼脂含量少，较软，常用来检查细菌的动力。细菌在半固体培养基中有两种生长现象：有鞭毛的细菌可沿穿刺线向四周扩散生长，穿刺线模糊不清，使培养基物呈放射状或云雾状；没有鞭毛的细菌不能运动，只能沿穿刺线生长，周围的培养基澄清透明。

（3）细菌在固体培养基中的生长现象：细菌在固体培养基上经过18～24h分离培养后，由单个细菌分裂繁殖后形成的肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。多个菌落融合成片，形成菌苔（mossy）。细菌种类不同，其菌落的大小、形状、颜色、边缘、气味、透明度、表面光滑度、湿润度以及在血平板上的溶血情况等均不相同（图8-11）。根据菌落的特征可以初步鉴别细菌。

3.细菌人工培养的意义

（1）在医学中的应用　细菌培养对疾病的诊断、预防、治疗和科学研究等多方面都具有重要的作用。①传染性疾病的病原学诊断：取患者标本，进行细菌分离培养、鉴定和药物敏感试验。这是诊断传染性疾病最可靠的依据，同时也可指导临床治疗疾病。②细菌的鉴定与研究：研究细菌的生理、遗传变异、致病性、免疫性和耐药性等，均需人工培养细菌。③生物制品的制备：将分离培养出来的纯种细菌，制成诊断菌液，供传染病诊断使用。制备疫苗、类毒素以供预防传染病使用。将制备的疫苗或类毒素注入动物体内，获取免疫血清或抗毒素，用于传染病治疗。④细菌毒力分析及细菌学指标的检测：人工培养细菌后，再用免疫学和其他方法检测细菌的毒力因子，并配合动物实验来鉴定细菌的侵袭力和进行毒力分析，也可以通过定量培养计数等，对饮水、食品等的微生物学卫生指标进行检测。

图8-11　细菌菌落形态

（2）在其他方面的应用　①在工农业生产中的应用：细菌在培养过程产生多种代谢产物，经过加工处理，可制成抗生素、维生素、氨基酸、酒、酱油和味精等产品。细菌培养物还可用于处理废水、垃圾和制造菌肥、农药及生产酶制剂等。②在基因工程中的应用：因为细菌具有繁殖快、易培养的特点，所以大多数基因工程的实验和生产，首先在细菌中进行。如将带有外源性基因的重组DNA转化给受体菌，使其在菌体内获得表达，现在用此方法已成功制备出胰岛素和干扰素等生物制剂。

二、细菌的遗传与变异

细菌在一定的环境中生长繁殖，通过DNA的复制，将亲代的各种性状稳定地传给子代，使种属保持原有的性状，称为细菌的遗传（heredity）。而细菌在繁殖过程中，由于外界环境条件发生变化或细菌的遗传物质本身发生改变，导致细菌的生物学性状发生相应的变化，称为变异（variation）。

（一）常见的细菌变异现象

1.形态结构变异

细菌在生长繁殖过程中受到不利因素的影响，如不适宜的温度、酸碱度、化学药品和抗生素等，常可发生形态结构的改变。

（1）细胞壁的变异　某些细菌在青霉素、溶菌酶等的作用下，细胞壁被破坏或细菌合成肽聚糖障碍，形成没有细胞壁的细菌。这些失去细胞壁的细菌在高渗环境中仍可生存，由于细胞壁的缺失不能维持其固有的形态，菌体呈现圆球形、长丝状或多形性，称为L-形细菌（L-form）。

（2）鞭毛的变异　有鞭毛的变形杆菌在0.1%石炭酸琼脂培养基上生长，可失去鞭毛，通常把这种鞭毛丢失的变异，称为H-O变异。

（3）细菌的一些特殊结构，如荚膜、芽胞、鞭毛等也可发生变异。

2.菌落的变异

细菌的菌落可分为光滑型（Smooth）、黏液型（Mucoid）和粗糙型（Rough）三类。当细菌菌落由S形变为R形时，细菌的毒力和抗原性等常会发生较大的改变，多见于肠道杆菌。这种变异类型，称为S-R变异。

3.毒力变异

细菌的毒力变异包括毒力增强和毒力减弱。如Calmette和Guerin把有毒力的牛型结核杆菌在含胆汁、甘油和马铃薯的培养基上经13年传230代，得到毒力减弱而抗原性稳定的菌株，即卡介苗（Bacillus of Calmette-Guerin，BCG），用于结核病的预防。

4.耐药性变异

原来对某种药物敏感的细菌，可以发生变异而形成耐药性。如金黄色葡萄球菌对常用的青霉素可产生耐药性，给临床治疗工作带来很大困难，成为当今医学上的重要问题。

（二）细菌变异的实际应用

1.在疾病的诊断、治疗与预防中的应用

由于细菌的变异可发生在形态、结构、染色性、生化特性、抗原性及毒力等各个方面，这给细菌的鉴定工作带来困难。如金黄色葡萄球菌随着耐药性菌株的增加，绝大多数菌株所产生的色素也由金黄色变为灰白色，许多致病菌血浆凝固酶试验不再呈阳性，使得葡萄球菌致病性的判断无法完全依赖已有的各种指标。因此在临床细菌学检查中不仅要熟悉细菌的典型特性，还要掌握各种细菌的变异现象和规律，只有这样才能对细菌感染性疾病作出正确的诊断。由于抗生素的广泛应用，临床分离的细菌中耐药株日益增多，更发现有对多种抗生素多重耐药的菌株，而新药开发研究的速度已跟不上细菌耐药性变异的形成。细菌遗传变异的研究对传染病的预防也具有重要的意义。用人工的方法减弱细菌的毒力而保留免疫原性的减毒株或无毒株，如卡介苗、炭疽和鼠疫减毒活疫苗，已成功用于相应传染病的预防。

2.在测定致癌物质中的应用

一般认为肿瘤的发生是细胞内遗传物质改变所致，因此凡能诱导细菌发生基因突变的物质都有可能是致癌物质。

3.诱变剂在临床和工业生产中的应用

诱导细菌基因突变的物质都可能危害人类健康，但在一定条件下，又可为人类所利用。例如，利用某些物理因素和化学因素（如结合补骨脂素和长波紫外线照射），灭活血制品内可能存在的微生物，提高输血的安全性。

4.在基因工程中的应用

重组DNA技术是基因工程的核心技术，是根据遗传变异中细菌可因基因转移和重组而获得新性状的原理设计的，不仅在生命科学的基础理论研究中发挥重要作用，而且为医药工业和农业生产开创了广阔的应用前景。目前通过基因工程已能使工程菌大量生产胰岛素、干扰素、各种生长激素、rIL-2等细胞因子和rHBs乙肝疫苗等生物制品，并可探索基因缺陷性疾病的治疗。

能力检测

1.简述细菌生长繁殖的条件、繁殖方式、速度及其规律。

2.细菌的合成代谢产物有哪些？各有何临床意义？

3.常见的细菌变异现象有哪些？有何意义？

（高江原）