靶向脂质体

第四节　靶向脂质体

一、靶向性的概念

目前临床上的大部分药物在体内到达作用部位之前，已被降解代谢或消除，有效药物浓度水平只占给药过程中短暂的一段时间;另外药物运输到全身，不但作用于靶组织，也作用于非靶组织，引起毒副作用。靶向性治疗就是利用载体药物释放系统改变药物的动力学，仅使药物作用于病变部位的靶细胞，而避免对正常细胞的作用。

一般地说，药物靶向传递有三种方法:①药物本身具有靶向能力;②将活性药物以药理惰性的形式(即前药)给予，在靶部位经化学或酶活化后发挥治疗作用;例如多巴胺的前药L－多巴，脂溶性高，可透过血脑屏障，在纹状体脱羧酶的作用下转变成多巴胺，发挥疗效;③利用生物惰性大分子载体系统将药物靶向于特定部位。其中，生物惰性大分子载体系统又分为两种类型:可溶性大分子药物传递系统(soluble macromolecular drug delivery system)和颗粒药物传递系统(particulate drug delivery system)。前者是指药物与大分子偶联，即形成大分子前药，在靶部位药物与大分子分离，发挥其治疗作用。所使用的大分子载体包括蛋白质(如抗体、抗体片段、白蛋白、糖蛋白、脂蛋白等)、凝集素、激素、葡聚糖、脱氧核糖核酸、合成聚合物(如聚－L－丝氨酸、聚谷氨酸、聚－L－天冬氨酸、HPMA等)。这类药物传递系统最大的问题是可携带的药物量少，一个大分子只能结合一分子药物;其次就是药物的活性基团有可能参与载体的偶联反应而降低或丧失治疗作用。颗粒药物传递系统是指药物分子掺入或包裹在载体基质内，如微粒、纳米粒、脂质体、胶团、脂蛋白等。

相对于可溶性大分子药物载体系统，颗粒药物载体系统①能携带较大量的药物;②将活性药物分散或包埋于载体基质内，一方面可增加药物分子的稳定性，防止外界介质的破坏、降解作用;另一方面也可防止在连接靶向分子的过程中，药物活性部位与靶向分子相互作用而降低或丧失治疗作用;③一个载体表面能连接多个靶向分子，表现较强的结合力;④同样地，一个载体表面可连接不同的靶向分子，使载体具有更精确的靶部位选择性。

同时，要达到药物靶向传递还存在着诸多障碍，例如:很快从血中代谢或排泄，不能达到或穿透到靶组织，被敏感的正常组织或细胞摄取等，这是药物靶向传递须着重考虑的问题。

载体药物释放系统进行药物靶向治疗是将药物连接载体，应用载体理化特性和选择性分布的特点，将药物特异地导人一定器官、组织和细胞的一种方法。掺入或包裹于载体的药物，只要与载体相连，药物的体内分布不取决于药物本身，而取决于载体的分布，这样递送药物到达游离药物难以到达的组织器官，不但增加了药物的靶向性，而且控制药物释放，降低药物毒副作用。

理想的药物载体复合物必须具备以下条件:①药物在体内输送过程中不被降解或过早释放;②具备特异靶向性，能被靶组织或细胞识别;③对宿主的毒性低且无副作用;④可按预期的速率释放药物;⑤可在宿主体内降解而不致积蓄;⑥具有生化稳定性而无免疫原性。

目前作为载体系统的主要有:①大分子载体如蛋白质、葡聚糖、DNA、脂质体和合成的多聚体;②颗粒载体如微粒和纳米粒(乙基纤维素微球，淀粉微球，聚苯乙烯纳米粒，聚丙酰胺微球等)，脂肪乳剂和磁力控制系统(携载药物和磁铁颗粒的白蛋白微球、聚苯乙烯微球);③细胞药物载体如红细胞，白细胞和其他细胞。一般认为最有前途的载体系统即是脂质体。

目前常用的靶向药物释放系统有以下几种类型:①利用载体的物理特性，使其在特殊微环境下释放药物，如温度敏感脂质体、pH敏感脂质体等;②将能识别特定组织、细胞的特异性配体如抗体、激素和糖蛋白质等直接联于脂质体，使其分布到相应的组织器官;③用磁场控制载体复合物的组织分布，如携载体与超微铁颗粒(Fe₃O₄)的脂质体对外部磁场的作用敏感，利用这种脂质体导向治疗肿瘤时，在肿瘤部位加磁铁，使脂质体分布于肿瘤周围的毛细血管床。

靶向性分三级:I级为器官组织靶向性，将药物靶向到特定的组织器官的毛细血管床;Ⅱ级为细胞靶向性，将药物选择性输送到特定的细胞如肿瘤细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等;Ⅲ级为细胞内靶向性，将药物导入细胞内亚细胞位点(如溶酶体、线粒体或核等)。

二、脂质体作为靶向药物载体的特点

脂质体作为靶向药物传递的载体，除具备上述颗粒药物传递系统的共同特点外，还有其独特的优势所在。

①脂质体的主要成分是磷脂和胆固醇，它们是哺乳动物细胞膜的天然成分，因此毒性很低，无免疫原性，无致热原性，能正常代谢和消除;

②脂质体的大小、成分、表面电荷等有很大的选择空间;

③脂质体能包裹亲水性和亲脂性的很多药物，包括酶、激素、维生素、抗生素和细胞因子等;

④制备简单;

⑤不同于固体的聚合物载体系统(如微粒、纳米粒)，脂质体双层脂膜是动态的结构，允许表面结合的靶向分子有更大的自由度，因此靶向分子能以最优构型与靶部位受体结合;

⑥脂质体还为所包裹药物的靶向性提供了新的可能性，包括细胞外释放、细胞膜融合和内吞，这样药物的靶向范围将更广泛;

⑦在载药脂质体表面结合不同的配基如抗体、糖脂等可将药物递送到特定靶组织和靶细胞。

三、脂质体靶向治疗的限制

脂质体作为药物与基因载体的应用前景主要取决于脂质体在体内的稳定性＇与靶细胞选择性作用和药物或基因释放人靶细胞内的效率与浓度。

在体内，靶向脂质体到达特定细胞需要成功地完成以下几个步骤:首先，脂质体必须到达靶细胞然后被靶细胞识别或它必须识别靶细胞或它的周围环境，脂质体选择性与靶细胞作用而几乎不对非靶细胞起作用;其次，载于脂质体的药物在释放位点能达到所需要的药物浓度;最后，药物靶向性不应产生不能允许的毒性程度。如果上述任何步骤不能成功地完成，药物的靶向性治疗就不能实现。

应用脂质体作为药物载体可以利用网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)吞噬作用，将未修饰脂质体靶向到RES细胞，但是作为药物载体靶向治疗RES外疾病有许多障碍，因为静脉注射脂质体后，脂质体快速被细胞和巨噬细胞从RES清除，脂质体主要聚集在肝、脾，其次是肺，淋巴结和骨髓。循环中的脂质体的逃避RES能力，不但取决于RES的功能状态，而且与脂质体的大小、组分、表面电荷和所带的配基有关口因此，封闭RES系统或改变脂质体的大小、组分，可以减少RES细胞的摄取。然而，封闭RES可以影响机体的防御功能。因此，任何增加脂质体循环时间的方法都不应该抑制RES防御效率。目前减少RES细胞对脂质体摄取的最有效的方法是改变脂质体的组分。

目前所用的长效脂质体主要有两种，一种是Allen提出的在脂质体膜上掺入GM₁这种脂质体称为隐蔽脂质体(stealth liposome);另一种是Klibaov等根据PEG与蛋白质结合后可以明显延长蛋白质半衰期的实验结果，提出在脂质体膜上掺入PEG的脂质衍生物以延长脂质体的循环时。GM₁以非特异性方式减少蛋白质与脂质体结合，延长脂质循环时间达GM₁最低浓度时形成最低电荷密度，提供脂质体表面足够的疏水性。掺入GM₁增加循环时的主要缺点是GM₁对不同种属的选择性强，对小鼠有效。对人则无效;另外GM₁的价格昂贵，而且难以大量提取或合成。掺入合成的PEG脂质衍生物延长脂质体循环时间，这些衍生物便宜，能够快速制备。在PC/Ch中掺入7．5 mol PEG－PC或PEG－PE可以延长脂质体的半衰期，减少肝脾的摄取。在SM/PC/Ch脂质体中掺入PEG－900与DSPC的氨基甲酸酯衍生物明显降低了RES摄取。PEG－PE结合物的立体化学屏障与PEG链的长度和分子量呈正相关。PEG链越长(相对分子质量可以达5000)，脂质体的循环时间越长。但是，对于DSPC/Ch胶态脂质体，PEG相对分子质量在1000～2000之间延长脂质体的作用最好。PEG提供了脂质体疏水表面与细胞表面配体的相互作用。

应用脂质体的另一个问题是静脉注射脂质体后大部分限制在血管。毛细血管的结构是脂质体从血循环中移出的屏障。根据组织微血管的结构将毛细血管分为三类:连续毛细血管、有孔毛细血管和窦状间隙毛细血管，至今尚无直接证据证实脂质体可完整穿过前两类毛细血管。窦状间隙毛细血管在全身仅见于肝、脾和骨髓，间隙平均直径为100 nm，肝脏允许200 nm的脂质体穿过，这样，小脂质体可以到达肝实质细胞。在骨骼肌、心脏、平滑肌以及肺、皮肤、皮下组织、浆液膜、黏液膜是连续毛细血管，这些血管间隙2～6 nm，这样即使是最小的脂质体也不能通过。有孔血管壁有30～80 nm孔，这些孔由一层薄膜覆盖。由于这种限制，靶向到血管外位点是成问题的。脂质体能靶向到血管外的组织器官包括肝、脾、骨髓。由于在这些器官存在带孔的毛细血管，直径小于200 nm的可通过这些孔离开循环，容易靶向达到的另一个血管外位点是实质性肿瘤，这些肿瘤的毛细血管比正常血管通透性高。血管通透性增加的部位还包括炎症组织和高血压血管损伤部位，这也是能用脂质体间接治疗血管外病变的理由。

四、靶向类型

脂质体靶向性分主动靶向、被动靶向和物理化学靶向三种。脂质体的被动靶向即应用非修饰脂质体聚集在某些组织的趋势。主动靶向性是修饰脂质体如连接配体或单克隆抗体到脂质体表面。物理化学靶向是掺入某些特殊脂质使脂质体对pH或温度变化等敏感，以使脂质体携带的药物作用于靶向位点。

1．被动靶向

被动靶向是利用药物载体固有的理化性质和体内分布规律，将药物输送到载体分布的组织器官而发挥作用的一种方法。未修饰脂质体的体内分布与其注入途径有关，静脉注射未修饰的脂质体，由网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)的细胞摄取，集中于肝、脾、肺、淋巴结和骨髓;肌肉和皮下注射的脂质体近80%贮存在注射部位，部分脂质体可以被巨噬细胞吞饮，到达邻近的淋巴组织。这对于导向治疗与RES有关的某些疾病是极有前途的，RES与血液中单核巨噬细胞(mononuclear phagocyte system，MPS)是宿主机体关键的防御系统，除了从循环中清除颗粒物质如外源性颗粒、微生物、衰老细胞和细胞碎片外，RES还参与宿主对失血、循环和败血症休克、创伤等反应。RES对维持机体防御反应具有多种作用，释放药物到这些细胞是放大宿主防御反应的一种有效方法，具有许多重要的临床意义。

应用脂质体包裹巨噬细胞因子被动靶向至RES，激活巨噬细胞清除肿瘤，这对于Ⅰ临床上辅助治疗肿瘤起重要作用。临床上多数死于实质性肿瘤的病人是由于转移而不是原发性肿瘤。目前所用的治疗方法不能有效地对抗大多数转移。用脂质体激活巨噬细胞治疗转移瘤是一种有前途的方法，激活的巨噬细胞能区别致肿瘤细胞和非致肿瘤细胞，它们能破坏肿瘤细胞包括对其他宿主反应机制和抗瘤药物耐受的肿瘤细胞。

巨噬细胞从循环中清除碎片尤其是衰老的红细胞，该过程是巨噬细胞的日常功能，与此相反，巨噬细胞如果破坏肿瘤细胞，它必须被激活。在体外、体内有两类物质可以激活巨噬细胞，一类是淋巴因子(lymphokines)，如γ－干扰素，另一类是细菌产物如细胞壁二肽(muramyl dipeptide，MDP)。

早期应用淋巴因子或细菌产物激活体内巨噬细胞治疗没有成功，这可能主要由于产物注射后半衰期短(2～60 min)，在它们发挥作用之前已从循环中清除。

脂质体作为激活因子的载体，可以将其有效地释放到RES细胞和巨噬细胞使这些因子发挥作用。含有PS、PG的负电荷的多层脂质体增加与巨噬细胞结合和被吞噬作用，而中性脂质体不能与巨噬细胞很好地结合。脂质体释放激活因子到巨噬细胞增加了对肺淋巴结转移瘤的破坏作用。

除了治疗转移瘤外，负电荷脂质体携载MDP增加了宿主对病毒抗感染的能力，明显增加了实验动物对各种细菌和真菌引起感染的抵抗力。Fidler等用磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)脂质体将细胞壁二肽活化因子靶向至巨噬细胞，用于实体瘤的治疗。

2．主动靶向性

脂质体本身无特异靶向性，必须在脂质双层上装上归巢装置(homing devices)才能具有组织特异性，常用的归巢装置有抗体、激素、糖残基和受体配体等。主动靶向是利用靶器官的结构和功能特点，人为设计和制备能选择性分布于靶器官的载体，将药物输送到特定的组织器官、细胞或亚细胞器的一种方法。这种方法特异性高，载体选择范围广，有较高的应用价值。

为了使靶向药物传递系统在体内成功地发挥靶向作用，靶部位的选择是非常重要的。静脉注射脂质体由RES快速从血循环中去除，肝脏的清除率最高，其次是脾，次之是骨髓。毛细血管的结构是脂质体从血循环中移出的屏障。连续毛细血管、有孔毛细血管和窦状间隙毛细血管中，至今尚无直接证据证实脂质体可完整穿过前两类毛细血管。窦状间隙毛细血管在全身仅见于肝、脾和骨髓，间隙平均直径为100 nm，肝脏允许200 nm的脂质体穿过。在骨骼肌、心脏、平滑肌以及肺、皮肤、皮下组织、浆液膜、黏液膜是连续毛细血管，这些血管间隙2～6 nm，即使是最小的脂质体也不能通过。有孔血管壁有30～80 nm孔，这些由一层薄膜覆盖。除了靶部位必须是循环容易到达的以外，靶部位结合点必须足够多，才能使药物浓度达到治疗水平。

细胞膜上的抗原、受体、细胞黏附分子等常作为靶结合位点，而相应的抗体、配体等作为靶向分子用于修饰载体。Snfimov等实验证明，人颈动脉脂质纤维斑块下有大量1型胶原，应用与牛或人的1型胶原的抗体，或人血浆的纤维连接蛋白相结合的脂质体，灌流牛、兔和人的动脉发现，带有识别标记的脂质体可选择性地与动脉结合。此外，与动脉内皮细胞单克隆抗体特异结合的脂质体经静脉注入小鼠，与动脉内皮细胞结合的脂质体占注入剂量的75%。

3．物理化学靶向

物理化学靶向是指在脂质体中掺入某些特殊脂质，使脂质体对pH或温度等变化敏感，以使脂质体携带的药物作用于靶向位点。如pH－敏感脂质体，热敏感脂质体，光敏感脂质体，磁性脂质体等。

热敏感脂质体也称温度敏感脂质体，该种脂质体受热到达其双层脂膜的相转变温度时，膜的通透性大大增加，释放内容物到受热部位，低于Tc时脂膜呈胶态，通透性小。应用时通过适当技术使靶部位温度稍高于Tc，导致脂质体快速释放内容药物。如前所述，在相变温度时，脂质体的磷脂膜产生从胶态过渡到液晶态的物理转变，大大增加脂质体膜的通透性，包封药物释放速度加快。按一定比例混合含不同长链脂肪酸结构的磷脂酰胆碱，可产生预期的相变温度。例如，若脂质体的相变温度约为42℃，可将治疗区(如癌肿区)局部升温至42℃，当温度敏感脂质体进入这一区域的毛细血管床时，脂质体发生相变，同时在某种血浆成分(主要是脂蛋白)作用下，脂质体迅速完全地释放药物，扩散后使血管内外的药物浓度达到平衡。这种物理靶向性不需要脂质体离开毛细血管。静脉注射含有甲氨蝶呤的温度敏感脂质体(DPPC/DSPC脂质体)，靶向到加热的L1210鼠肿瘤细胞，药物释放和摄取的量与不加热的肿瘤相比较，肿瘤的药物浓度增加了14倍。释放率依赖于温度变化率，脂蛋白能增加脂质体释放药物。

pH－敏感脂质体由不饱和的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)和脂肪酸组成，在pH7．4时稳定，在低pH不稳定。在pH＜6．5的酸性环境下，脂质体即与相邻的膜发生融合，这时pH－敏感脂质体释放包裹的药物到胞浆。这种特性是由于脂质体中含有不饱和PE，它在中性生理环境下即可形成六角相，需加入某些脂肪酸以制成稳定的脂质体。当pH＜6．5时，脂肪酸的羟基质子化，脂质形成六角相，引起膜的融合。病理组织的pH比正常组织低，感染部位、原发肿瘤和转移肿瘤组织pH比正常组织低，炎症反应后60 h，该部位的pH降低至6.5。细胞内吞空泡的pH范围为5．0～6．5，由于脂质体主要通过内吞被细胞摄取，脂质体达到的细胞内位点是溶酶体，在溶酶体脂质体逐渐被破坏．在多数情况下药物不能直接到达细胞浆，然而，pH－敏感脂质体在内吞体酸性环境下不稳定，脂质体膜即与内吞体膜融合，将内容物释放至胞浆。

制备pH敏感脂质体可用对pH敏感的类脂，如N－十六酰－L－高半胱氨酸(N－palmitoyl－L－homocysteine，PHC)，游离的高半胱氨酸。这些类脂因pH不同，存在二种平衡结构，一种是开链式，一种是环式，例如PHC的平衡构型为:pH降低时，闭合的PHC是一种中性类脂，破坏脂质双层的稳定性，脂质体内的药物不断释放出去。用超声法制备各种比例DPPC、DSPC(二硬脂酰磷脂胆碱，distearoyl phosphatidyl choline)和PHC的羧基荧光素(CF)脂质体，测得CF的释放是温度和pH的函数。由12% PHC和88% DPPC制备的pH敏感脂质体，具有温度和pH的交互作用，在33℃时pH显示的差异最大(pH6．8～7．4)。Yatvin等设计了一种pH敏感脂质体，该脂质体除利用体内局部组织的低pH环境外，还利用外加磁场的作用，使包封的离子性药物在指定区域释放出来。

pH敏感免疫脂质体DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)在生理条件下不能形成稳定的脂质双层结构，而以六角晶相存在，加入酯酰化的抗体使之形成脂质体。当抗体与抗原作用时，由于多价结合，抗体分子发生侧向移动和聚集，脂质体上DOPE由于失去抗体蛋白的稳定作用而发生六角相变，将包裹的内容物释放出来。

光敏感脂质体在脂质体膜中掺入光敏物质，当受到光照射时，光敏物质结构发生变化，从而释放药物至光敏部位。

磁性脂质体将超微磁粉Fe₃O₄包入脂质体，利用外磁场将其定位于体内靶部位。

五、靶向性评价

靶向性评价是靶向给药系统中的重要内容。靶向评价一般是通过定量来实现的，药物的浓度(c)，药浓－时间曲线下面积(AUC)和组织内药量一时间曲线下面积三个参数是常用的定量指标。

1．相对摄取率r_e

式中，AUC_i是浓度－时间曲线算得的第i个器官或组织的药时曲线下面积，脚标m和s分别表示脂质体和溶液。r_e大于1，表示脂质体在该器官或组织有靶向性，r_e愈大，靶向性愈好，r_e小于1表示无靶向性。

2．靶向效率t_e

式中，AUC靶和AUC非靶分别是靶器官或靶组织与非靶器官或非靶组织的浓度时间曲线下面积。t_e大于1，表示脂质体对靶器官或组织比非靶器官或组织有选择性，t_e愈大，选择性愈强。脂质体的t_e与溶液的t_e相比较的倍数，说明脂质体靶向性增强的倍数。

3．峰浓度比C_e

式中，c_p为峰浓度，每个组织或器官中的C_e值表明脂质体改变药物分布的效果，C_e愈大，表明改变药物分布的效果愈明显。