人工制备的抗体

三、人工制备的抗体

（一）单克隆抗体

McAb是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体，简称单抗。其理化性状高度均一、效价高、只与一种抗原决定簇发生反应、生物活性单一，具有高度特异性又易于大量制备。

1.单克隆抗体制备的基本原理　杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，既能够分泌抗体又能在体外长期繁殖，经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。

（1）细胞的选择与融合　①致敏B细胞：首先用抗原免疫的BALB/C健康小鼠，使小鼠脾细胞被激活成为具有分泌抗体能力的浆细胞。②选择骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞为B细胞系恶性肿瘤，能在体外长期增殖并容易与B细胞融合。③细胞融合：细胞融合是制备单克隆抗体的中心环节。有多种方法可使细胞融合，包括物理方法（如电场诱导）、化学方法和生物学方法（如仙台病毒）等，化学法最常用的助融剂是相对分子质量为1000～2000 D（道尔顿）的PEG，使用浓度在30％～50％之间。

（2）选择性培养基的应用　致敏B细胞与骨髓瘤细胞的融合是随机的，经过融合过程后将有几种形式的细胞出现：融合的瘤细胞与B细胞、融合的B细胞与B细胞、融合的瘤细胞与瘤细胞、未融合的瘤细胞、未融合的B细胞和细胞的多聚体形式等。这些细胞中，细胞的多聚体形式容易死亡，未融合的B细胞在体外仅存活5～7 d，故无须特别筛选。而未融合的瘤细胞能在体外生长繁殖，可影响杂交瘤细胞的生长，因此需要筛选去除，只留下B细胞杂交瘤。利用HAT选择培养基可以达到此目的，其作用方式是根据细胞内核苷酸的生物合成途径而设计的。

（3）有限稀释与抗原特异性选择　在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个表位，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答，实质是众多B细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体，需筛选去除。

2.单克隆抗体制备技术流程（图6-2）。

图6-2　单克隆抗体制备流程

3.单克隆抗体在医学中的应用　单克隆抗体一问世便在生物学等医学研究领域中显示了其极大的应用价值，特别是在诊断和防治疾病、判断预后以及研究疾病发病机制等方面发挥了巨大的促进作用。目前单克隆抗体作为医学检验诊断试剂主要应用于：

（1）诊断各类病原体　这是单克隆抗体应用最广泛的领域，已有大量的商品诊断试剂供选择。如用于诊断乙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒等各种微生物感染的试剂。

（2）诊断和治疗肿瘤　检测肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原，可用于肿瘤的诊断；利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位，为人类恶性肿瘤的免疫治疗开辟了广阔前景。

（3）检测淋巴细胞的表面标志　用于区分细胞亚群和细胞分化阶段。如检测CD系列标志，有助于了解细胞的分化情况、T细胞亚群的数量和质量变化，对多种疾病诊断具有参考意义。

（4）机体微量成分的测定　应用单克隆抗体和免疫学技术，可测定机体的多种微量成分，如酶类、激素、维生素、药物等，对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和治疗均具有实际意义。

知识与技能拓展

单克隆抗体的优点与局限性

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建杂交瘤技术。这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性差的问题，表现出其独特的优点：①用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。②适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法。③可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。但单克隆抗体也存在着其局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围；反应强度不如多克隆抗体；制备技术复杂、费时费工、价格较高。

（二）基因工程抗体

基因工程抗体又称重组抗体，是指应用DNA重组技术及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和加工，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。

目前基因工程抗体技术主要包括两部分内容，一是应用DNA重组和蛋白质工程技术对已有的单克隆抗体进行改造，包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备；二是用抗体库技术筛选、克隆新型单克隆抗体。

1.人源化抗体

（1）嵌合抗体　又称人-鼠嵌合抗体，是从杂交瘤细胞中分离出鼠源单克隆抗体功能性V区基因，经基因重组与人抗体C区基因连接成嵌合基因后，插入适当的表达载体中，再共同转染宿主细胞，即可表达人-鼠嵌合抗体分子。嵌合抗体保留了单克隆抗体对抗原的特异亲和性，又降低了鼠抗体的免疫原性。

（2）改型抗体　是应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区的骨架区序列取代鼠源单克隆抗体CDR以外的骨架区序列，重新构成既有鼠源单克隆抗体的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人体几乎无免疫原性。

2.小分子抗体　小分子抗体指相对分子质量较小但具有抗原结合功能的分子片段。它的优点表现在以下几个方面：①免疫原性低且相对分子质量小，易于穿透血管或组织到达靶细胞部位，可用于免疫治疗。②可在大肠杆菌等原核细胞中表达，降低生产成本。③不含F_C段，不会与带有F_C受体的细胞结合，副作用小。④半衰期短，有利于中和并及时清除毒素。小分子抗体包括：抗原结合片段（Fab）、可变区片段（Fv）和单链抗体等。

3.特殊基因工程抗体

（1）双特异性抗体　又称双功能抗体。它不同于天然抗体，其两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性的抗原发生结合。可通过化学交联法或将两种杂交瘤细胞融合而制备，也可采用基因工程技术制备双特异性抗体。

（2）抗体融合蛋白　是将抗体分子片段与其他蛋白融合所得到的产物。这种抗体融合蛋白具有多种生物学功能。例如将抗体Fab段或Fv段与其他生物活性蛋白融合，就可将特定的生物学效应导向靶部位；将ScFv与某些细胞膜蛋白融合，则可形成嵌合受体，赋予特定细胞以结合抗原的能力；若将非抗体蛋白与抗体分子的Fc段融合，可改善其药代动力学特性，并可使某些生物学活性与抗体的生物学功能相联。

（3）抗体库技术

抗体库技术是指用细菌克隆代替B细胞克隆来表达抗体谱。它的出现基于PCR技术的发展、大肠杆菌直接表达抗体分子片段的成功以及噬菌体显示技术的问世。抗体库技术的主要特点为：①方法简单快速，与单克隆抗体制备相比，既省去细胞融合之繁琐，又避免动物免疫之局限。②选择范围广泛，抗体基因库的抗原特异性可高达10⁸～10¹⁰。③可模拟体内免疫系统亲和力成熟过程来制备高亲和力抗体。④无需人体免疫接种过程即可获得特异性人源化抗体。⑤便于大规模生产。

思考题

一患者于注射破伤风抗毒素（TAT）5小时后出现四肢抽搐、呼吸困难、胸闷不适、面色苍白、大汗淋漓等严重的症状，经医院抢救后脱离危险。试分析使用TAT时应注意的问题。

（张其霞）