基因治疗研究进展

肿瘤的基因治疗是近年来研究的活跃领域，但是在临床应用方面虽然被广泛地应用，但是尚未有大组的临床病例报道，多数是作为辅助性治疗而展开的，因此基因治疗作为新技术的一项标志，还需要做大量的工作，特别是临床应用和观察更多的循证数据，近年来的主要进展如下。

（一）基因重组免疫毒素LHRH-PE40的靶向治疗

促黄体激素释放激素-铜绿假单胞菌外毒素A（luteinizing hormone releasing hor monepseudomonas aeruginosa exotoxm．40，LHRHPE40）是一种导向治疗癌症的药物，用基因工程的方法将LHRH基因和一部分铜绿假单胞菌外毒素基因重组后在大肠杆菌中表达出的一种融合蛋白，基因重组毒素LHRH-PE40的靶向特异性进行了较系统的研究。LHRH-PE40的作用原理是通过重组毒素中的载体LHRH部分与癌细胞表面LHRH受体结合，然后再通过内乔作用由弹头部分的铜绿假单胞菌外毒素A蛋白跨膜转运至细胞内特异性杀死癌细胞。激素受体在体内各组织中的分布相当特异，在某些恶变细胞表面性激素受体的表达量异常增高，这是选用激素作为导向载体的主要原因。LHRH-PE40在选择性地杀伤相应的表达有LHRHR肿瘤细胞的同时，对正常细胞影响较少或无影响。由于铜绿假单胞菌外毒素A是在细胞内发挥作用，所以LHRH-PE40对LHRHR阴性表达的细胞较少或无影响。现将载体部分LHRH和弹头部分PE-40分别介绍如下。

1．载体部分LHRH

（1）LHRH的结构、构效关系及其分子生物学特性：LHRH是一个不含游离氨基酸与羧基的10肽，其分子结构为P-Glu-His-TRP-Ser-Tyr-Cly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2。其中第4～6位氨基酸可形成β转折，呈发夹形，适合与受休结合；第2位和第3位对生物活性很重要；第6位对维持发夹构象起重要作用；第1位与第4～10位均参与受体结合，若置换以上氨基酸残基可导致其活力丧失或呈几何级增强。

（2）LHRHR分布：①人类正常的性腺（子宫内膜、子宫肌层、卵巢和睾丸）、胎盘和大脑组织的细胞膜上有LHHHR的分布。②不排除其他正常组织细胞膜上有亲和力极低的LHRHR存在的可能，如肝脏。③LHRHR主要分布在肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宮内膜癌、子宫肌瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞膜上。

2．弹头部分PE-40　铜绿假单胞菌（绿脓杆菌，Pseudo-monas aeruginosa，nosa，PA）是一种革兰阴性杆菌，广泛存在于土壤、水和各种动物体内，为一种条件致病菌。PA感染是一种最为常见的严重并发症，尤其在烧伤、烫伤患者中更多见。1966年Liu等证实，由PA产生的外毒素A（Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PEA）是其主要致病因子。后来研究发现，PEA类毒素可使机体产生高水平的抗PEA抗体，证明PEA类毒素疫苗有可能作为PA感染的预防制剂。研究同时发现，PEA具有结构独特、毒性强、易内化和特异性强等优点，是良好的生物导弹弹头材料。

（1）铜绿假单胞菌外毒素A的结构与功能：Allured等对PEA晶体的X线衍射分析表明，PEA是由613个氨基酸组成的单链毒素蛋白，分子量66kD，其前体为638个氨基酸，在分泌过程中切去了由25个氨基酸组成的高度疏水的引导肽。从PEA的晶体结构中得知其在空间上分为3个结构域（domain，D）区，即Ⅰ区、Ⅱ区和Ⅲ区。

（2）PEA的作用机制：近年来的研究表明，细胞毒作用有相当复杂的功能。PEA的毒性本质是催化真核细胞的延伸因子-2（elongation factor-2，EF-2）的ADP-核糖基化，阻止肽链延长，中断细胞蛋白质合成，而行使细胞毒作用。

（3）PEA在重组毒素上的应用：PEA单一肽链具有细胞结合、转位和酶活性三种功能的结构特点，并具有量少、高效和特异等优势，因而在免疫毒素的研究中备受青睐。目前，用于构建PE重组免疫毒素均是去除了细胞结合部位的PE衍生物，丧失了非特异细胞结合能力，但保留了转位能力和细胞活性，也降低了免疫原性。现主要有以下几种PE重组免疫毒素。①PE4E：是将PE分子的第57、246、247和249位的氨基酸残基诱变为Glu而丧失与细胞结合的能力。②PE40：是将PE分子的非特异结构域DIa（第1～252位）氨基酸残基去除。③PE40KDEL：是将PE40分子的羧基端REDLK置换成KDEL，其活性可提高6～10倍。④PE38：是在PE40的基础上进一步除去非特异结构域（第365～380位）氨基酸残基，减少了PE分子上的一个二硫键。⑤PE38KDEL：是将PE38分子的羧基端REDLK置换成KDEL，其活性可提高6～10倍。⑥PE35：是在PE38的基础上，进一步除去跨膜转运结构域部分氨基酸残基（第253～279位），使分子中的二硫键均被删除，而活性不受影响。

以Pastan为首的美国国立卫生研究院（NIH）癌症研究所分子生物学实验室，近年在这方面从不同角度开展了工作，取得了优异的成果，有的重组毒素已进入临床试验。表6-6概括了目前已进入临床Ⅰ期的以PEA为弹头的重组免疫毒素。从现有的临床试验数据可以预测，重组免疫毒素在癌症和艾滋病等人类目前尚无有效治疗手段的疾病上显示出广阔的应用前景。

表6-6　已进入临床Ⅰ期的以PEA为弹头的重组免疫毒素

EGFR．表皮生长因子受体；erbB2．表皮生长因子受体2；IL-R．白细胞介素-4受休；Le Y．Lewis相关抗原

3．LHRH-PE40与癌细胞表面LHRH受体结合特性　作者进行了LHRH-PE40与癌细胞表面LHRH受体结合特性的研究，实验证实LHRH-PE40与人宫颈癌（Hela）、喉癌（Hep）和肝癌（HEPG）细胞株膜表面LHRHR结合的亲和常数（Kd）分别是0．36、0．33和0．43nmol／L，而LHRH与上述三种细胞结合的Kd分别是4．86、4．68和4．86nmol／L，LHRH-PE40的Kd比LHRH小1个数量级。因此，可以推断，LHRH-PE40不仅保持了LHRH与其受体结合的特性，而且其结合力超过了LHRH本身。这种结合力的增加也可能是由于IMRH-PE40比LHRH分子量更大，在体外实验更稳定，不易分解所致。由此证实，LHRH-PE40能与肿瘤细胞表面LHRHR特异结合，而促甲状腺激素释放激素（thyrot-ropin-releasing hormone，TRH）则不能。结果提示，LHRH-PE40能够发挥其导向作用，这为其用于治疗LHRHR过度表达的肿瘤提供了实验依据。

4．国产重组免疫毒素LHRH-PE40的研究进展　由军事医学科学院11所科研人员研制的具有独立知识产权的“冻干人重组促黄体激素分泌激素-铜绿假单胞菌外毒素A融合蛋白（LHRH-PE40）”（商品名：比欧米塞），2005年获得由国家食品药品监督管理局颁发的一类创新性生物制品类新药临床研究批件，并已于2007年顺利通过临床Ⅰ期观察，现已进入临床Ⅱ期研究阶段。通过基因工程方法构建了适合于大规模生产LHRH-PE40重组毒素工程菌（表达量占菌体总蛋白的30%），经体内外实验表明对肿瘤细胞有明显的靶向杀伤作用，而对正常体细胞毒性反应小。该蛋白质稳定性好，肿瘤细胞杀伤彻底，适用于胃癌、肝癌、结肠癌和黑素瘤等的特异性治疗，尤其对一些放疗不敏感的腺癌更有其独到之处。

（二）肿瘤基因治疗疗效评价及应用前景

目前，肿瘤基因治疗尚处于Ⅰ期临床试验阶段，主要研究其临床使用的安全性和毒性反应等，故其治疗对象的选择也仅限于那些肿瘤高度恶性、已有常规治疗未曾奏效、预期寿命很短且常已有全身扩散转移的病例，即主要是晚期癌症病人。晚期黑色素瘤除具备上述特点外，尚具有病灶位于体表、取材活检方便、利于疗效观察等优点，故已成为目前肿瘤基因治疗最常使用的肿瘤模型。从目前已报道的一些病例资料看，基因治疗的不良反应较小，未产生原先预期可能产生的一些不良反应，故其临床应用可能是安全的。但由于本疗法目前主要用于晚期癌症病人，其疗效尚不够理想。Rosenberg报道的6例使用TNF-TIL治疗的晚期黑色素瘤病人，仅一例加用大剂量IL-2后产生明显疗效，而3例仅用TNF-TIL者和另2例使用TNF-TIL加IL-2的病人，并未见明显疗效，这与目前较常用的LAK或TIL治疗时的疗效相比也并无提高。

目前，进入临床试验阶段的肿瘤基因治疗研究项目已多达几十项，但大部分方法治疗的病例数还很少，观察疗效的时间也很短，故尚不足以据此对其疗效进行较全面的评价。有人认为，肿瘤基因治疗至少在目前还未成长为一类独立的治疗手段，而应与其他治疗手段联合使用，作为肿瘤综合治疗的一个组成部分。虽然从目前动物实验研究的情况及基因治疗技术本身所蕴涵的巨大潜能来看，这是一个很有希望的研究领域。但由于肿瘤基因治疗是一类高技术方法，其技术过于复杂，成本也极高，故即使在美国，目前也仅适合在少数大的医疗中心开展。因此，仅从成本与效益比来看，可以说在今后一个较长的时期内，肿瘤基因治疗还不可能成长为肿瘤临床治疗的一种主要的或常规的手段。

（三）肿瘤基因治疗及需要解决的问题

肿瘤基因治疗虽然已成为人类克服肿瘤这一顽症新的希望所在，但目前尚存在许多需要解决的问题。例如在技术上，目前所用的各种基因转移载体的基因转染效率均较低，仅10%左右，这就使得目的基因的表达达不到期望的有效浓度，且目前基因转移载体大多仅适用于离体方法（ex vivo），故今后除应加强研制高效转染和表达的基因载体外，还应注重研究可直接应用于人体，且在体内可特异进入靶细胞或靶组织的载体，尤其是原位基因转移技术。此外，经体外遗传操作的细胞的体外维持、扩增、移植及回输体内的细胞在体内的生长、稳定有效的基因表达的维持等方面，目前也存在很多问题。有人认为，Rosenberg的TNF-TIL疗法之所以疗效不佳，除其TIL瘤灶定位性能不够好外，TNF在肿瘤部位的分泌量低则是另一个主要原因。在这一方面，我们认为，采用肿瘤特异性增殖病毒进行的基因-病毒治疗是一个很有前途的研究方向。

虽然肿瘤基因治疗的开展可能不存在伦理学难题，但其安全性仍是一个需要关注的问题。目前使用的各种病毒基因载体，虽在使用上各有长处，但均存在病毒载体与野生型病毒或内源性前病毒发生重组而导致病毒血症甚至致癌的危险；病毒随机整合至宿主靶细胞基因组，可产生插入突变或导致一些重要基因的灭活；由于病毒载体是蛋白质和核酸的混合物，产生后无法纯化至单一成分，故在其生产和使用过程中若污染了病原微生物如有复制能力的反转录病毒或外源RNA等也较难检出，而病人使用后就有可能为野生型病毒感染，或由于RNA反转录为cDNA插入靶细胞基因组而使宿主接受了不必要的甚至是有害的外源遗传物质。已有报道表明因野生型辅助病毒的存在可使猴发生淋巴瘤；在病毒载体的大规模生产过程中也发生过因基因重组而产生大量野生型病毒的事故。故在今后的研究中，用遗传工程技术排除危害性重组发生的可能性，发展其他定向定点整合或同源重组的基因载体也是今后基因转移载体研究的方向。

1．端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗　在上述我们进行的以端粒酶为靶点的肿瘤基因治疗研究中，也还有许多问题需要认真对待。首先，有10%左右的人类肿瘤没有端粒酶活性，其中有一部分是依靠非端粒酶依赖机制（alternative lengthening of telomere，ALT）维持端粒长度，因此针对端粒酶的肿瘤治疗方案对这些肿瘤或细胞群体不起作用；其次，在人类生殖细胞、造血干细胞等正常细胞中也可检出端粒酶活性，以端粒酶为靶点的肿瘤治疗可能会给这些细胞造成毒性反应；最后，迄今为止绝大多数靶向端粒酶的抗肿瘤研究还都停留在体外细胞和动物模型上，尚未过渡到临床，其抗肿瘤的临床远期效果还仅在推论中。针对上述问题，我们进行了认真的思索和研究。第一，在所有肿瘤的治疗方案中，没有一项是可以针对所有肿瘤的，以端粒酶为靶点的治疗可以靶向85%以上的各种肿瘤，是目前最为广谱的肿瘤基因治疗方案。第二，通过选择合适的治疗策略，可以提高肿瘤的治疗效果，如以端粒酶hTERT启动子控制的增殖性腺病毒载体，携带抗肿瘤基因，靶向端粒酶阳性的肿瘤细胞并杀灭肿瘤细胞，其介导的抗癌基因高效表达，可以同时对周围端粒酶阴性的肿瘤细胞群体起抑制作用。这种联合病毒与基因的治疗策略，对晚期播散性肿瘤的治疗尤其显示出独特的优势。第三，生殖细胞、造血干细胞等正常细胞的分裂能力明显低于肿瘤细胞，其端粒长度较肿瘤细胞长，端粒酶活性也远不如肿瘤细胞高，因此以端粒酶活性抑制为目标的基因治疗方案可以设计为在正常细胞端粒耗尽前终止，之后其端粒酶活性可得以恢复。而以端粒酶激活为目标的治疗方案中，选择性增殖病毒载体在较低端粒酶活性的正常细胞中复制的程度很低，对正常细胞的损害很微弱。

2．干细胞靶向治疗　血液系统肿瘤可以使治疗更精细，其他实体肿瘤治疗的发展趋势也特别强调更有针对性，如针对肿瘤干细胞的靶向治疗就是如此，虽然目前其治疗效果还在观察研究之中，但这毕竟是迈开了肿瘤精细治疗的第一步，近年来，在国内外临床上都十分的活跃，靶向肿瘤干细胞表面分子的治疗是根据肿瘤干细胞的特有表面标记可成为靶向药物作用的靶点。利用携带细胞毒药物的抗体靶向相应的肿瘤干细胞特有标记，或找到与其他种类细胞不同的参数，区分肿瘤干细胞，进而特异地消灭这一细胞亚群，这是一个非常好的思路。对于白血病，靶向抗原可选择CD123分子，其表达于肿瘤干细胞而非正常造血干细胞的特性很适合作为靶向治疗的目标。大多数AML母细胞表面表达白细胞介素-3受体（IL-3R），Feuring-Buske等分别用体外培养和移植至NOD／SCID小鼠体内证明了白喉毒素-IL-3融合蛋白对AML母细胞和肿瘤干细胞群有毒性作用，而对正常前体细胞无毒性。在化疗前或化疗中同时应用ABCG2抑制剂或抗ABCG2抗体，可增加CSC对化疗药物的敏感性，能有效帮助清除肿瘤干细胞。

其中，CF120918（烟色曲霉素中获得的真菌霉素）和tariquidal．（p-gp抑制剂）的复合物（同时抑制ABCG2和ABCB1）已用于临床研究。由干肿瘤干细胞在肿瘤组织中存在比例很小（小于5%）以及目前经实验鉴定的肿瘤干细胞表面标记还十分有限，所以利用携带药物的抗体靶向特殊表面标记还只是实验阶段，还有很长的路要走。除了针对细胞药物敏感性之外还有针对靶向肿瘤干细胞通路的治疗，wnt／β-cateninin、Notch和Shh等信号通路是肿瘤干细胞与正常干细胞在自我更新方面具有重要作用，这些信号通路异常表达可导致肿瘤的发生。药物干扰调节肿瘤干细胞自我更新的信号传导通路的靶向治疗是一个很有前景的肿瘤治疗策略。有人利用RNAi技术，下调结肠癌Wnt通路中关键蛋白β-catenin的表达，结果显示被处理的细胞在软琼脂上形成克隆和在裸鼠体内成瘤的能力均明显下降，表明肿瘤干细胞的增殖能力被有效抑制。有人发现，干扰β-catenin／TCF转录通路的小分子阻断剂，降低Wnt靶基因表达，可以产生对培养髓细胞瘤的细胞毒性，体内应用可以延长荷瘤模型生存期。这提示，可以通过抑制β-catenin通路来杀伤乳腺癌干细胞。有人通过靶向阻断脑瘤细胞中Notch通路，发现肿瘤细胞中凋亡及分化数量明显增高，而分化的肿瘤细胞不再具有致瘤特性。随后，他们发现阻断Notch通路能够明显减少CD133＋脑肿瘤干细胞的数量。虽然针对干细胞通路的药物已在开发，但是必须考虑肿瘤干细胞与正常干细胞的信号转导途径有何差别，怎样才能保证药物能特异性杀死肿瘤干细胞而不影响其他正常干细胞。

（1）诱导肿瘤干细胞的分化：肿瘤分化疗法是采用诱导肿瘤细胞分化的同时阻止肿瘤细胞进一步增殖的治疗方法。全反式维A酸（all-trans retinoic，ATRA）最早被用于肿瘤的促分化治疗，在对急性早幼粒细胞性白血病（acute promye-locytic leukemia，APL）的治疗中表现出良好的疗效。Munster等使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理乳腺癌细胞MCF-7，可观察到明显的细胞分化特征。另外，化疗药物大麻素（cannabinoid）也被证实具有诱导胶质瘤干细胞分化及抑制肿瘤发展的作用。肿瘤干细胞往往分化异常或分化受阻，因此，诱导肿瘤干细胞分化可以消耗其分裂潜能，起到抑制肿瘤的作用。目前，更多新的分化诱导药物也正在开发过程中。

（2）利用正常干细胞靶向肿瘤干细胞：神经干细胞（neural stem cell，NSC）具有惊人的迁移和趋向肿瘤的能力。Brown等将NSC经尾静脉注入裸鼠神经或非神经源性肿瘤模型，发现NSC可通过周围脉管系统迁移定位至颅内和颅外非神经肿瘤区域，包括前列腺癌和恶性黑色素瘤。因此，研究者设想将NSC作为一种携带治疗基因的载体，利用其趋向肿瘤的能力而靶向多种类型的肿瘤干细胞，从而发挥抗肿瘤药物，达到有效的靶向治疗作用。

（3）破坏微环境：微环境是肿瘤干细胞赖以生存的基础，对于调节肿瘤干细胞的自我更新、持续存活及维持小部分细胞处于相对静止状态，非常必要。肿瘤干细胞的微环境也称为壁龛（niche），破坏壁龛会严重影响干细胞的正常功能。Calabrcse等证实，脑肿瘤干细胞位于内皮细胞附近的区域，脱离了该区域会影响肿瘤干细胞的增殖能力。此外，在小鼠脑内成瘤实验中，与人内皮细胞共注射的脑肿瘤干细胞增殖能力明显强于单独注射的脑肿瘤干细胞。Jin等用CD44的单克隆抗体H90阻断CD44与其功能受体的结合，以阻碍AML干细胞向壁龛转移，结果大大抑制其增殖和成瘤的能力。已有研究发现，以脑肿瘤起始细胞的血管微环境为靶点的治疗，可以减少肿瘤起始细胞的数量，终止肿瘤生长。乏氧作为肿瘤治疗的主要问题之一，同样存在于肿瘤干细胞的微环境中，因此，可以利用这点进行治疗。Huang等创建了一种新的基因治疗载体，能在乏氧环境下特异表达，使针对乏氧的特异靶向治疗成为可能。

（4）采用药物靶向制剂治疗：这种方案是将药物用纳米材料包裹，或与具有靶向性的材料以共价键结合，其优势在于能够有效提高治疗靶点的药物浓度，减少非特异性和不良反应，同时又可避免药物间的相互作用。多柔比星（阿霉素）和聚羟丙酯甲基丙胺（HPMA）的聚合物能在一些药物外排泵周围聚集，这充分证明了高分子药物结合物的潜在优势。有研究者发现，CD44是大部分肿瘤干细胞的表面分子，透明质酸是其天然配体，结合了透明质酸的化疗药物对表达CD44受体的肿瘤细胞具有明显的靶向性。但是，这种治疗也存在比较多的问题，主要是肿瘤干细胞并不高表达特异性的受体，机体本身也具有特殊性，靶向性材料在机体的降解问题，这些都限制药物靶向制剂的应用。

（5）肿瘤干细胞耐药性的逆转：肿瘤干细胞的耐药特性导致了化疗疗效欠佳，因此，学者考虑去除其耐药特性，则可以提高疗效。耐药机制主要是细胞中的某些物质，可以将进入胞内的化疗药物选择性地向胞外转运，从而使细胞得以存活。首先，干细胞处于静止状态，且绝大多数停留于CO期，从而能有效避免细胞毒化疗药物的打击；其次，干细胞特征之一就是多药耐药基因的高水平表达，因此，许多学者认为干细胞参与了临床上肿瘤耐药现象。Nakai等报道，免疫组织化学染色显示，培养的U877胶质瘤干细胞中表达MDR1和CD133蛋白，后者是白血病干细胞和胶质瘤干细胞的表面标志。实时定量PCR结果发现，对比U877胶质瘤细胞中MDR1和CD133分子表达，其干细胞中二者表达分别增加了8．51和47．18倍。而且，U877胶质瘤干细胞对化疗药物阿霉素、依托泊苷、顺铂和双氯乙基亚硝脲等强烈耐受。双免疫荧光染色显示，MDR1和CD133共表达于转入裸鼠脑部的U877胶质瘤干细胞中，表明肿瘤干细胞可对目前的化疗耐受，而且可能是胶质瘤治疗的一个关键靶。利用化疗药物主要转运子抑制剂，可以逆转耐药性，第一代的逆转剂ABCB1抑制剂主要包括维拉帕米和环孢霉素A，通过与抗肿瘤药物竞争p-gp上的结合位点，从而抑制跨膜泵作用，使药物累积增加，逆转耐药性，但疗效并不理想。环孢素A的衍生物PSC833是第二代p-gp逆转剂，其逆转作用是环抱素A的520倍，而且无免疫抑制和肾毒作用，抑制时间强于维拉帕米。fumitremorgin C（FTC）是ABCC2的天然抑制剂，并与细胞内药物蓄积量呈正相关，对p-gp和ABCB1同样有抑制作用，只是具有神经毒性，不适合临床应用；化学合成的FTC衍生物Ko143可以增加某些药物的肠道吸收，提高小鼠肿瘤细胞对药物的敏感性，且高剂量口服或腹腔注射小鼠无明显毒性作用。GF120918是从烟色曲霉素获得的真菌霉素，Cisterni-no等发现其可抑制ABCB1，并在体内和体外均可显著抑制ABCG2。另外，针对ABCC2的一些其他疗法，如用锤头核酶、5D3抗ABCG2单克隆抗体或RNA干扰来调节ABCC2的功能，在临床治疗中取得了较好的效果。

综上所述，肿瘤干细胞概念的提出，提供了靶向性或选择性杀伤肿瘤干细胞的可能性，从而达到治愈肿瘤、防止肿瘤复发和转移的目的。肿瘤干细胞理论的提出是人类认识肿瘤的一大进步，为研究肿瘤发病机制及根治恶性肿瘤提供了一个新的方向。随着人们对肿瘤干细胞生物学特性的进一步阐明，针对肿瘤干细胞研发的疫苗、抗肿瘤干细胞药物、信号通路阻断剂及其他化学物质等，将会攻克肿瘤干细胞的辐射抗性和耐药性，在诱导肿瘤干细胞分化和凋亡及抑制增殖等方面发挥治疗作用，从而为肿瘤的治愈带来新的希望。