的转录后加工

真核生物mRNA的初级转录产物也称为非均一核RNA（heterogeneous nuclearRNA， hnRNA），必须进行5′－端和3′－端的修饰以及剪接（splicing），才能成为成熟的mRNA，并被转运到核糖体，指导蛋白质合成。

（一）5′－端的修饰

大多数真核mRNA的5′－端有7－甲基鸟嘌呤的帽结构。RNA PolⅡ催化合成的新生RNA长度达25～30个核苷酸时，其5′－端的核苷酸就与7－甲基鸟嘌呤核苷通过不常见的5′，5′－三磷酸连接键相连（图10－14a、c）。5′－帽合成酶是一个由鸟苷酸转移酶（guanylytransferase）和甲基转移酶（methyltransferase）形成的复合体，与RNA Pol的CTD末端相结合。首先，新生RNA的5′－端核苷酸的γ－磷酸被水解，在鸟苷酸转移酶的作用下与另一个GTP分子的5′－端结合，形成5′，5′－三磷酸结构。帽结构中首位鸟嘌呤的N－7位和后续核苷酸的核糖2′－O位还能进一步甲基化，催化的酶分别为鸟嘌呤－7－甲基转移酶和2′－O－甲基转移酶，甲基均由S－腺苷甲硫氨酸（S－adenosyl menthionine，SAM）提供（图10－14b）。帽结构形成后通过帽结合蛋白（cap－binding protein，CBD）一直停留在RNA Pol的CTD末端处，直至转录终止才离开（图10－14c），帽结构可保护mRNA免遭核酸酶的水解，在蛋白质合成过程中也有特殊作用。

图10－14 真核mRNA的5′－帽结构及合成过程

（a）5′－帽结构；（b）5′－帽结构的合成；（c）5′－帽结构在CTD末端合成

（二）3′－poly（A）的添加

绝大多数真核mRNA的3′－端都有poly（A）尾巴，长度为80～250个腺苷酸。前体mRNA上的断裂点也是聚腺苷酸化（polyadenylation）的起始点，断裂点的上游10～30bp有AAUAAA信号序列，断裂点的下游20～40bp有富含GU的序列。聚腺苷酸化过程在核内完成，因为尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。

poly（A）的长度随mRNA的寿命而缩短，因此通过提纯测到的结果很难准确反映体内poly（A）的实际长度。poly（A）长度与该模板翻译活性相关，poly（A）的有无与长短是维持mRNA作为翻译模板的活性以及增加mRNA本身稳定性的因素之一。一般真核生物在胞质内出现的mRNA，其poly（A）长度为100～200个核苷酸，也有少数例外，例如组蛋白基因的转录产物，无论是初级的或成熟的，都没有poly（A）尾结构。

前体mRNA分子的断裂和poly（A）的形成是多因子参与的复杂过程（图10－15）。首先，聚腺苷酸化特异性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor，CPSF）与AAUAAA信号序列形成不稳定的复合体；然后加入断裂激动因子（cleavage stimulatory factor，CStF）、断裂因子Ⅰ（cleavage factorⅠ，CFⅠ）、断裂因子Ⅱ（CFⅡ），其中CStF与断裂点下游富含GU的序列相互作用而稳定该复合体；此后再加入多聚腺苷酸聚合酶［poly （A）polymerase，PAP］。上述各因子协同作用使前体mRNA分子在断裂点断裂，并立即在断裂点游离3′－OH进行多聚腺苷酸化。多聚腺苷酸化有两个阶段：慢速期完成大约前12个腺苷酸的添加，此时速度较慢；而后，复合体中加入多聚腺苷酸结合蛋白Ⅱ（poly（A） binding proteinⅡ，PABⅡ），它可与慢速期合成的多聚腺苷酸链结合，引导聚合反应进入快速期，当poly（A）尾结构达到足够长时，PABⅡ还能使PAP停止多聚腺苷酸化。

图10－15 真核mRNA 3′－poly（A）的生成过程

（三）mRNA的剪接与剪切

细胞核内的hnRNA分子量往往比在胞质内出现的成熟mRNA大几倍，甚至数十倍。核酸序列分析证明，mRNA来自hnRNA，而hnRNA和DNA模板链可以完全配对。已知绝大多数高级真核生物的结构基因均为断裂基因（split gene），即由若干个外显子（exon）和内含子（intron）相互间隔连接而成，其转录产物去除内含子再连接后，可转变为成熟mRNA，后者才能作为翻译模板，此过程即为mRNA剪接（mRNA splicing）。外显子是指在初级转录产物及成熟mRNA中均出现的核酸序列，内含子是指隔断基因的线性表达而在转录后的剪接过程中被除去的核酸序列。

图10－16显示了鸡的卵清蛋白基因及其hnRNA进行的mRNA剪接。卵清蛋白基因全长为7．7kb，有8个外显子和7个内含子。hnRNA与其基因等长，内含子尚未除去。成熟的mRNA分子仅为1．8kb，其所含阅读框为386个氨基酸编码。

图10－16 卵清蛋白基因及其转录、转录后加工

图中DNA序列中红褐色并用数字表示的部分是外显子，其中L是前导序列；用字母表示的黄绿色部分是内含子

mRNA剪接过程较为复杂，首先是内含子弯曲形成套索RNA（lariatRNA），使相邻的两个外显子互相靠近而利于剪接，此步骤还包含了内含子3′－端的嘌呤甲基化。

大多数内含子都以GU为5′－端的起始，而其末端则为AG－OH－3′。5′－GU……AG－OH－3′称为剪接接口或边界序列。剪接完成后，GU或AG不一定被剪除。剪接过程的化学反应称为二次转酯反应（twice transesterification）（图10－17）。

外显子E1与E2之间的内含子I因与剪接体结合而弯曲，5′－端与3′－端互相靠近。内含子可因小部分碱基与外显子互补而互相依附。第1次转酯反应需要细胞核内的含鸟苷酸p G、ppG或pppG的辅酶，以3′－OH基对E1/I之间的磷酸二酯键进行亲电子攻击，使E1/I之间的共价键断开。pG取代E1成为5′－端，E1的3′－OH游离出来，所以称为转酯反应。第2次转酯反应由E1的3′－OH对I/E2之间的磷酸二酯键进行亲电子攻击，使I与E2断开，由E1取代了I。这样，两个外显子被连接起来而内含子被切除掉。在这两步反应中磷酸酯键的数目并没有改变，因此也没有能量的消耗。

图10－17 剪接中的二次转酯反应

mRNA剪接是在剪接体（spliceosome）上进行的，剪接体是一种核内特异的RNA－蛋白质复合体，称为核小核糖核蛋白颗粒（small nuclear ribonucleoprotein particle，snRNP）。它可与hnRNA结合，使内含子形成套索并拉近上、下游外显子。每一种snRNP含有一种核小RNA（small nuclearRNA，snRNA）。snRNA有5种：U1、U2、U4、U5和U6，长度100～300个核苷酸，分子中碱基以尿嘧啶含量最丰富，因而以U命名。真核生物从酵母到人类， snRNP中的RNA和蛋白质都高度保守。剪接体是一种超大分子（supramolecule）复合体，主要由上述5种snRNA和大约50种蛋白质装配而成，剪接体装配需要ATP提供能量。

如图10－18所示，首先，内含子5′－端和3′－端的边界序列分别与U1、U2的snRNA配对，使snRNP结合在内含子的两端；而后，U4、U5和U6加入，形成完整的剪接体，此时内含子发生弯曲而形成套索状，使上、下游的外显子E1和E2靠近；最后，结构调整，释放U1、U4和U5，而U2和U6则形成催化中心，发生转酯反应。

真核生物hnRNA的加工除上述的剪接方式外，还有其他2种方式：一种是剪切（cleavage）模式，此方式在剪去某些内含子后，不与下游的外显子连接，直接在上游的外显子3′－端进行多聚腺苷酸化；另一种为可变剪接（alternative splicing）模式，或称选择性剪接，即在加工时选择性剪切掉某个外显子再相互连接。此2种方式可以单独进行，也可两者均有。大多数真核生物hnRNA经过加工只能产生一种成熟的mRNA，翻译成相应的一种多肽。但也有少数真核生物hnRNA能以此2种方式生成不同的mRNA，已发现这些真核生物hnRNA分子中具有多个多聚腺苷酸化的位点。如图10－19所示，免疫球蛋白重链基因的前体mRNA分子就是通过选择不同多聚腺苷酸位点，经剪切形成免疫球蛋白重链的多样性；果蝇肌球蛋白重链的hnRNA分子在不同的发育阶段通过选择性剪接，可产生3种不同形式的mRNA，从而生成3种不同的肌球蛋白重链。降钙素（calcitonin）基因表达出一种hnRNA分子，此hnRNA在大鼠甲状腺剪切后再成熟，最后产生降钙素；而在大鼠脑细胞，剪切和选择性剪接这2种机制同时参与，最后生成降钙素－基因相关肽（calcitonin－gene related peptide，CGRP），详见图10－20。

图10－18 剪接体的生成与剪接过程

图10－19 真核生物hnRNA的剪切与剪接

图10－20 大鼠降钙素基因hnRNA的剪切与剪接

（四）mRNA的编辑

mRNA编辑（mRNA editing）是指成熟mRNA的某些序列经特定方式可发生改变，从而产生不同的翻译产物。人类有2种载脂蛋白B，分别为apoB100（分子量513000）和apoB48（分子量250 000），前者由肝细胞合成，后者则存在于小肠黏膜细胞。但研究发现人类基因组上只有apoB100一个基因，可见转录后发生了一些变化。已证实这2种apoB均由apoB100基因的转录产物——mRNA编码。apoB48的生成是由于肠黏膜细胞存在胞嘧啶核苷脱氨酶（cytosine deaminase），可对apoB100基因产生的mRNA进行编辑。此酶与mRNA第2153位氨基酸的密码子（CAA，编码Gln）结合，使其中的C脱氨转变为U，由此CAA转变成了终止密码UAA，使翻译终止于第2 153位，所以apoB48实际上缺失了apoB100第2 153位至C－端的肽链（图10－20）。同样的例子可见于脑细胞谷氨酸受体（GluR），它是一种离子通道，GluR－mRNA发生脱氨基使A转变为G，导致一个关键位点上的谷氨酰胺密码子CAG变为精氨酸密码子CGG。被编辑过的GluR－mRNA其翻译产物含精氨酸，此种GluR对Ca2＋不通透，表现出不同功能的脑细胞具有不同的受体，对离子的通透性具有了选择性。RNA编辑的存在提示，基因的编码序列经过转录后加工可有多种产物。

图10－21 肝细胞、小肠黏膜细胞apoB100基因的mRNA编辑