高效养殖模式岗位年度工作综述

时间：2022-11-16 百科知识版权反馈

【摘要】：2011年，本岗位集中开展了国家鲆鲽类主产区养殖模式调研工作，根据调查，目前我国循环水养殖鲆鲽类仍然在沿海地区分布（图1），这与目前循环水对天然海水和地下井水的依赖关系密切。随着循环水养殖工艺的不断完善和成熟的养殖模式推介，工厂化循环水养殖必将在我国得到稳步发展。特别是山东省海水养殖业的迅猛发展，沿海地下水资源处于负均衡状态，并出现不同程度的水位降落漏斗，海水入侵、水质污染问题严重。

2　高效养殖模式岗位年度工作综述

2．1　国家鲆鲽类主产区养殖模式调研工作

2011年，本岗位集中开展了国家鲆鲽类主产区养殖模式调研工作，根据调查，目前我国循环水养殖鲆鲽类仍然在沿海地区分布（图1），这与目前循环水对天然海水和地下井水的依赖关系密切。沿海地区的土地资源因为港口、码头、旅游、房地产的开发而日益短缺，随着循环水养殖技术完善，内陆河流、湖泊可以发展鲆鲽类的循环水养殖。

鲆鲽类主产区循环水养殖现有规模和发展趋势：

经过对辽宁省、河北省、天津市和山东省的工厂化循环水养殖模式调查研究，现有的循环水养殖面积约为32万平方米，而据统计，目前我国鲆鲽类工厂化养殖总面积为475万平方米，如图2所示，循环水养殖面积只占工厂化养殖总面积的6%，由此看来，循环水养殖尚有巨大的发展空间。例如辽宁省的天正公司在2011年新建10　000m²的循环水养殖车间，河北省的江鹏养殖公司新建1　000m²、天津市的立达公司新建5　000m²并计划在2012年新建10万平方米、山东省的明波公司计划在2012年新建10万平方米的循环水养殖车间。从2007年至2011年的5年期间，我国循环水养殖鲆鲽类面积由2007年的4万平方米、产量720t上升至2011年的32万平方米、产量2　000t（图3）。随着循环水养殖工艺的不断完善和成熟的养殖模式推介，工厂化循环水养殖必将在我国得到稳步发展。

图2　循环水养殖面积占工厂化养殖面积比

图3　2007年至2011年期间鲆鲽类循环水养殖规模变化

2．2　国家鲆鲽产业体系主产区（辽宁、山东）养殖地下水资源普查工作报告

对辽宁省、山东省的养殖地下水资源做了调查工作。

图4　辽宁调查路线图

　　　　　　图5　山东调查路线图

辽宁省的调查结果表明：

（1）辽宁省采用地下井盐水养殖大菱鲆单位相对较少，且分布不均。主要集中在葫芦岛和兴城沿海。其中，以兴城渔业园区面积最大。这主要是辽宁省地下水资源分布情况决定的。

（2）养殖园区的水质情况尚属优良，未检测到重金属、石油烃等超标。园区所排放的污水中除CODcr值和SS值之外其他污染物质均符合标准；园区地下水中除氨氮值之外其他指标均符合标准。

（3）在现状开采条件下，该地区地下水资源处于负均衡状态。渔业园区水量集中开采，致使南北两区出现不同程度的水位降落漏斗，随着开采时间的增加，漏斗中心不断加深，北区的降落漏斗受稻田淡水开采的影响，中心逐渐向内陆方向移动。

（4）养殖区地下水系统的补给量主要由海水侧向补给和大气降水补给组成，最主要的排放方式是人工开采量。在现状开采条件下，降水入渗补给量占总补给量的11．4%，海水侧向补给量占总补给量的77．6%，其余为流量边界侧向补给，灌溉回渗补给和河流渗漏补给量。人工开采量占总排放量99%以上。

（5）目前，在每天一个循环量的开采条件下（2　318．728×10⁴m³／a），50%降水保证年份养殖区地下水可开采资源量为2　337．268×10⁴m³／a，75%降水保证年份地下水可开采资源量为2　287．476×10⁴m³／a。

（6）养殖区面临严重的海水入侵问题。二十世纪八十年代末，研究区地下水的开发利用，已引起了沿岸地区的海水入侵。由于其时段地下水开发利用量相对后期较小，同时海水入侵需要一个过程，该时段区域海水入侵引起的地质环境问题相对较轻。进入九十年代后，随着地下水开采量的加大，区域降水偏枯年组的出现，海水入侵日益严重。由于现代渔业园区的建立，大量沿岸布井开采咸水资源，客观上起到了截流开采的作用，同时采取了限制地下水开采等措施，对缓解研究区西部的海水入侵起到了一定的作用，但东部的农灌井开采量仍大于区域的地下水可开采量，故研究区东部的海水入侵仍有扩大趋势。

（7）在对渔业园区开采井布局进行优化的基础上，考虑地下水系统多年均衡以及海水入侵不加剧的要求，得出研究区地下水最大可开采量为2　349．04×10⁴m³／a，盐度超过10的最大可开采量达1　894．98×10⁴m³／a，盐度超过20的最大可开采量为1　664．80×10⁴m³／a，盐度超过30的最大可开采量1　467．81×10⁴m³／a。

建议：

（1）加强井盐水资源管理。井盐水资源需要合理开发利用并有效保护，才能被持续利用。明确管理部门，落实管理措施，对井盐水资源统一规划，保护和管理。

（2）合理规划，适度开发。渔业园区的发展要因地制宜、合理规划、适度开发、要留有余地，以地下水量来决定养殖面积。要按照具体情况，进行点状开发，按条状或带状发展。开发前期做好地下井盐水资源量勘测和水质分析，避免盲目投资。

通过对山东省地下水资源的调查，我们发现，虽然山东的地下水资源可开采总量较大，然而随着全省工业和农业的迅速发展，地下水资源的开发利用程度较高，开发潜力和空间已经不大。特别是山东省海水养殖业的迅猛发展，沿海地下水资源处于负均衡状态，并出现不同程度的水位降落漏斗，海水入侵、水质污染问题严重。

为实现地下水资源的可持续利用，应注意以下几点：

（1）加强地下水开采管理。地下水资源需要合理开发利用并有效保护，才能被持续利用。明确管理部门，落实管理措施，对地下水资源统一规划，保护和管理。

（2）合理规划，适度开发。以地下水量来决定养殖面积，按照具体情况，进行点状开发，按条状或带状发展。开发前期做好地下水资源量勘测和水质分析，避免盲目投资。

（3）采用污水集中收集处理措施和封闭式循环水系统，既缓解了经验水的短缺又减轻了无水对海域的污染，封闭式循环水养殖系统可节约60%～70%的地下水。

（4）加强地质普查与水质监测。建立地下水动态监测网，对地下水开采量、地下水水位、水质进行系统监测，为合理开发利用水资源提供科学依据。

（5）继续开展井盐水利用与海水入侵关系研究。如盲目发展海水养殖，扩建盐田，引起海水入侵，导致良田盐碱化，作物枯死，机井报废，人畜无水可饮，后果严重且难以恢复。对此应采取谨慎严肃的态度，确保地下水养鱼能迈向可持续发展的新阶段。

2．3　大菱鲆促性腺激素基因cDNA克隆及体外表达研究

从已构建的大菱鲆正常生长和胁迫刺激cDNA文库中，通过批量测序的方法得到了大菱鲆促性腺激素GTHα和GTHⅠβ亚基基因cDNA序列，并且采用体外重组表达的方式得到了原核表达的GTHα和GTHⅠβ亚基蛋白，目前正在进行相关检测试剂盒的开发以及相关基因工程产品在大菱鲆生殖、繁育中的应用研究。

2．3．1　大菱鲆促性腺激素基因cDNA克隆

大菱鲆促性腺激素GTHα亚基的cDNA序列全长671bp，包含长度为366bp的核心编码区，编码122个氨基酸的多肽链，其中包括长度为23个氨基酸的信号肽和99个氨基酸的成熟多肽（图6）。通过生物信息学软件预测大菱鲆GTHα亚基蛋白相对分子质量为11．06×10³，等电点为8．09。

图6　大菱鲆GTHα亚基的cDNA核心编码区序列及其氨基酸序列，下划线所示为信号肽序列，终止密码子TGA用星号表示

大菱鲆促性腺激素GTHⅠβ亚基基因cDNA核心编码区长度为363bp，编码120个氨基酸的多肽链，包括18个氨基酸的信号肽和102个氨基酸的成熟多肽（图7）。通过生物信息学软件预测大菱鲆GTHⅠβ亚基蛋白相对分子质量为11．2×10³，等电点为4．76。

图7　大菱鲆促性腺激素GTHⅠβcDNA序列及其成熟多肽氨基酸序列，终止密码子TAA用星号表示

经过NCBI Blast比对，获得的大菱鲆促性腺激素GTHα亚基基因cDNA序列与Gene Bank库中其他鱼类的GTHα亚基基因cDNA序列相似性达80%以上，进一步对其编码的氨基酸进行序列分析，发现获得的序列与其他鱼类促性腺激素α亚基成熟肽的相似性在60%～80%之间，其中与Scomber japonicas GTHα的氨基酸同源性最高为78%而与其他鲆鲽类的相似性为塞内加尔鳎71%、庸鲽69%、牙鲆67%，并且在多肽链中存在氨基酸连续缺失的现象，这一结果显示出大菱鲆促性腺激素α亚基与鲽形目其他物种存在一定的差异，这种氨基酸连续缺失的位点是否影响到大菱鲆生殖调控的功能差异还有待进一步研究。

图8　大菱鲆GTHα亚基氨基酸序列与其他鲽形目物种的同源性分析

图中框表示的是其他鲽形目物种GTHα亚基氨基酸序列相对于大菱鲆均存在4～5个的氨基酸连续缺失。

经过NCBI Blast比对，获得的大菱鲆促性腺激素GTHⅠβ亚基其编码的氨基酸与其他鱼类促性腺激素GTHⅠβ亚基成熟肽的相似性在40%～65%之间，其中与Micropterus salmoides GTHⅠβ的氨基酸同源性最高为65%而与其他鲆鲽类的相似性为牙鲆58%、塞内加尔鳎57%、庸鲽53%，这一结果显示出大菱鲆促性腺激素GTHⅠβ亚基与鲽形目其他物种存在一定的差异，其在大菱鲆生殖调控中的功能差异还有待进一步研究。（图9）

图9　大菱鲆促性腺激素GTHⅠβ亚基氨基酸序列与其他鲽形目物种的同源性分析

采用生物信息学软件对大菱鲆促性腺激素GTHα和GTHⅠβ亚基进行了结构预测，并与已知脊椎动物的促性腺激素GTHα和GTHⅠβ亚基蛋白进行了结构分析比较。结果显示，由cDNA序列所推出的氨基酸序列构成的蛋白质三级结构与库中其他物种的促性腺激素GTHα和GTHⅠβ亚基的三级结构非常相似，存在基本相同的受体结构域。（图10、11）

2．3．2　大菱鲆促性腺激素基因GTHα亚基体外重组表达研究

将大菱鲆促性腺激素基因GTHα亚基cDNA ORF经DNA限制酶双酶切后，连接载体，经过鉴定，构建了大菱鲆促性腺激素基因GTHα亚基蛋白表达载体TGtHα－vector，通过转化的方式导入E．coli中，筛选出阳性重组子克隆并进行菌种保存。对筛选出的大肠杆菌

图10　大菱鲆促性腺激素GTHⅠα亚基氨基酸序列空间结构

图11　大菱鲆促性腺激素GTHⅠβ亚基氨基酸序列空间结构

菌株采取IPTG诱导其进行体外表达，并对表达产物进行纯化，最后采用SDS－PAGE电泳方法对表达产物进行了检测分析。结果表明，大菱鲆促性腺激素表达蛋白大小约为14×10³；表达产物的量随着诱导时间的增加而增加，在3小时左右蛋白表达达到最大值，2 mmol／L IPTG可有效诱导促性腺激素GTHα的表达，表达蛋白主要以包涵体形式存在并能够利用His标签进行有效纯化。

目前正在利用已经纯化得到的大菱鲆GTHα蛋白开发大菱鲆促性腺激素检测试剂盒，大菱鲆专用重组促性腺激素产品也在研制开发中。

图12　大菱鲆促性腺激素GTHⅠα重组阳性克隆检测结果

电泳检测结果：泳道1～5，阳性克隆的电泳结果与实际片段大小相符

图13　大菱鲆促性腺激素GTHⅠα重组阳性克隆测序结果

测序结果与获得的大菱鲆促性腺激素GTHⅠα序列完全一致，说明外源大菱鲆促性腺激素GTHⅠα成功连接到载体上后，已成功导入E．coli中。

图14　大菱鲆促性腺激素GTHⅠα蛋白电泳结果

M：Protein MW Marker，从上到下依次为97．2×10³，66．4×10³，44．3×10³，29．0×10³，20．1×10³和14．3×10³；

A：纯化产物；B：超声波沉淀；C：超声波上清；D、L：诱导4h；E、H未诱导；F、G：空白大肠杆菌E．coli对照；I、J、K、L、N：分别为诱导1、2、3、4、5小时。

2．4　大菱鲆非正常长度生长激素受体基因cDNA克隆

从高密度养殖的大菱鲆下丘脑cDNA文库中克隆得到一种非正常长度的生长激素受体基因cDNA，其序列不同于国外报道的正常长度和短小化的鲆鲽类生长激素受体。大菱鲆非正常长度生长激素受体GHR基因cDNA核心编码区长度为1　767bp，编码589个氨基酸的成熟肽序列（图15）。

图15　大菱鲆非正常长度生长激素受体基因cDNA核心编码区序列

将大菱鲆非正常长度生长激素受体基因与已经报道的包括正常长度和短小化的鲆鲽类生长激素受体基因进行分析比对，发现大菱鲆非正常长度生长激素受体亚基的部分位点与大菱鲆和其他鲆鲽类生长激素受体基因均存在较大的差异，特别是与已报道的大菱鲆短小化生长激素受体基因在多数位点仍然有碱基的不同缺失，推测该序列的产生可能与高密度养殖条件相关。国外文献报道在脊椎动物中随着生长条件的改变，也会相应作用于不同类型生长激素受体的分泌表达，进而调控与生长状态相联系的不同类型的细胞的生长和分化。本项发现为从基因水平揭示集约化条件下大菱鲆养殖品种的生长差异寻找到了新的途径，也为研究鲆鲽类养殖品种的性状退化提供了新的分子依据。

图中阴影处表示的是大菱鲆非正常长度GHR一个连续43个碱基的缺失位点；绿框表示短小化的大菱鲆GHR碱基缺失的位点；红框表示鲆鲽类正常长度和短小化在该位点的序列差异情况，其中牙鲆、大菱鲆、庸鲽在该位点的缺失为两段，分别为14个碱基和23个碱基。

2．5　转牙鲆生长激素基因酿酒酵母的制备及其应用

构建了一种基于蛋白表面展示系统的重组牙鲆生长激素酿酒酵母菌株表达载体PYD－E2，其采用GAL1启动子和酿酒酵母URA3基因上游和下游序列能够保证牙鲆生长激素基因能够稳定整合在酿酒酵母的基因组染色体上；通过7周的生物活性研究，0．5%饲养组的生长速率和饲料转化率分别比对照组高23．07%和21．57%，1%饲养组分别为28．85%和41．18%，显示出良好的促生长效果及应用前景。