海产贝类染色体核型分析

实验十二　海产贝类染色体核型分析

一、实验目的

（1）掌握海产动物染色体制备方法。

（2）了解海产生物染色体核型分析的过程和方法。

二、实验原理

全世界已知的软体动物生活种约10．7万（Hinegardner，1974），分属7个纲、11个亚纲、36个目，其中瓣鳃纲（又称双壳类）约有1．5万种，海产的占87％。我国四大海水养殖贝类（牡蛎、缢蛏、蛤仔、泥蚶）以及其他大多数有重大经济价值的贝类养殖品种（例如，海湾扇贝）都属于这一纲，可见，瓣鳃纲在我国水产养殖贝类中占有重要地位。因此，对软体动物染色体方面（例如，核型，带型）的研究，不仅可以探讨其在分类系统的地位和系统演化过程，从细胞遗传学以及更深一层的分子遗传学角度，解释物种所具有的生物学特征，而且对于我国重要经济种类，如太平洋牡蛎（表12．1），在其遗传、变异以及育种等方面提供理论依据和实践指导。

关于软体动物的染色体，很早就有人研究，Lillie（1901）报道Elliptio com-planata的染色体（n＝16）；Jordan（1910），Morris（1917）报道过Cumingia telli-noides的染色体数（n＝18，2n＝36）。但直到20世纪60年代，仅仅有150种的染色体有所记载，染色体制备技术不完备是制约其发展的主要原因。60年代以后，由于采用人类染色体分析的一系列新技术，贝类染色体研究进入了蓬勃发展的新阶段。原来的组织切片法（Jordan，1910；Morris，1917）因操作复杂，制片时间长，染色体易丢失或相互覆盖等不足而被淘汰，取而代之的是压片法和空气干燥法。研究方法的不断更新、改良，使染色体制片质量大大提高，同时，对染色体核型的研究，又提高了贝类染色体分析的精确度和可靠性。

目前，在已知染色体的种类中，瓣鳃纲的近200种，腹足纲的700多种，多板纲的近20种，掘足纲的3种，头足纲的近10种，而单板纲、无板纲的则鲜有报道，与贝类丰富的种群相比，还有很大差距。

染色体是遗传物质的主要载体，认识染色体的结构与功能，对研究遗传规律、变异机理及多倍体育种具有重要意义。分生组织是观察细胞核和染色体的好材料，通过药物处理易得到较好的细胞分裂相。在染色体的分析研究中，有关染色体标本的制备方法很多。目前，牡蛎染色体观察方法主要有成体鳃为材料的体细胞滴片法和以4～8细胞期胚胎为材料的压片法。

表12．1　太平洋牡蛎Crassostrea gigas染色体数目及核型

三、实验材料

太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的鳃组织，4～8细胞期胚胎或幼虫。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

显微镜，离心管（或培养皿），解剖刀，剪子，镊子，载玻片，盖玻片，吸管，烧杯，加热器，500目筛绢，300目筛绢，温度计，恒温水浴锅，染色缸等。

2．药品试剂

秋水仙素，甲醇，冰醋酸，吉姆萨（Giemsa）染液，磷酸缓冲液（pH值为6．8～7），氯化钾，苏木精，铁明矾等。

五、实验方法和步骤

1．滴片法

（1）取材：挑选活力强的太平洋牡蛎洗净外壳，活体解剖立即取鳃小片，用过滤海水迅速冲洗一下。

（2）秋水仙素处理（即预处理）：由于在观察研究体细胞染色体的工作中，以有丝分裂中期的染色体最为合适，将鳃小片移入盛有用50％海水配制的秋水仙素的离心管中，处理30～45min（水温8℃～15℃）。

（3）低渗：移入25％海水中（或0．075M的KCl液）低渗30～45min。

（4）固定：低渗结束后移入盛有卡诺氏固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）试管内固定，固定液需要更换3～4次，每次时间为15min。

（5）制片：

①将干净载玻片放在恒温水浴锅上，恒温水浴锅表面温度控制在50℃±2℃预热。

②细胞悬液的制备：将充分固定的鳃标本的试管内的固定液倒掉，加入45％～50％的冰醋酸轻轻摇，鳃细胞就解离下来，此时可见试管内溶液变得浑浊，细胞浓度应控制在50万～150万个／毫升。

③滴片：用干净的细管取上述解离液，离载玻片高度15～20cm，每片载玻片可滴5～6滴，滴定后立即用细管将滴液吸净，自然干燥后备用。

④染色：将干燥后的载玻片置于PBS浸泡2min后，放于盛有10％Giemsa染液的染色缸中，浸染20min，染色结束后用自来水冲洗染片，干后在镜下进行观察。

（6）显微摄影：在光学显微镜下用油镜观察并选择分散好、形态好的中期染色体进行显微摄影，将照片放大。

（7）染色体核型分析：将放大照片上的一个细胞内的全部染色体，分别一条一条剪下，按照Levan（1964）划分标准编号排列。用胶水将染色体按顺序在贴在一张硬纸板上，计算它们的相对长度臂长着丝粒指数，得核型公式，并绘制核型模式图。

2．压片法

（1）取卵：先把成熟的牡蛎外壳洗刷干净，活体解剖后，选择成熟的种贝，用滴管刺破性腺获取精、卵，先用300目筛绢过滤一次，再用500目筛绢洗去组织液，卵子最好用海水浸泡30min。

（2）授精：把获得的好精、卵进行人工授精，在水温22℃～25℃条件下进行发育。

（3）秋水仙素处理：当胚胎发育至4细胞期～8细胞期时，立即用500目筛绢网浓缩出胚胎，放入用50％海水配制的0．05％的秋水仙素的离心管中进行处理。

（4）低渗：移入25％海水中（或0．075M的KCl液）低渗30～45min。

（5）固定：低渗结束后移入盛有卡诺氏固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）内固定，固定液需要更换3～4次，每次时间15min。

（6）压片：

①滴片：将上述固定好的胚胎滴2滴到干净的载玻片上，自然干燥。

②染色：将风干后的载玻片滴上铁矾苏木精液数滴，染色1～2min，放上盖玻片在乙醇灯小火烤一下，立即准备压片。

③压片：用软纸折叠后先用铅笔轻轻敲打盖玻片几次，再用食指轻轻压紧一段时间，具体应根据经验而灵活掌握。总之，要达到染色体分散开，伸展开，不断裂和逸出细胞之外，便于镜检。

（7）封片：通过镜检合格的压片可作为永久制片，先用二甲苯透明10～20 min，再用光学树胶封固，在37℃的干燥箱中放置24h。

（8）显微摄影：在光学显微镜下用油镜选择分散好、形态好的中期染色体进行显微摄影，并将照片放大。

表12．2　二倍体太平洋牡蛎染色体的核型统计

六、实验中需特别注意的事项

（1）载玻片必须清洗干净，否则效果不好或失败。

（2）染色时间以染色体深度着色为准，染色时间与染液质量、染液pH和材料处理好坏有关，应灵活掌握。如染色过浅可重复染；过染可用乙醇退色，水冲洗后，重染。

（3）秋水仙素的处理时间和浓度应灵活掌握，随温度不同而需要调整。

（4）Giemsa染液受pH影响明显，pH偏酸时胞质着色较深，pH偏碱时核染得很红。为获得良好着色，用卡诺氏固定液固定的细胞最好放置过夜，或吹干，让冰醋酸充分挥发。否则，在此酸性条件下，细胞核不易着色，发白，而胞质深蓝色。

（5）PBS缓冲液的配制：（1／15）mol·L^-1NaHPO₄50mL，（1／15）mol·L^-1KH₂PO₄50mL，pH＝6．81。

（6）吉姆萨（Giemsa）染液配制：吉姆萨粉0．5g，甘油33mL，甲醇33mL。

（7）卡诺氏固定液现用先配。

七、作业

（1）制备太平洋牡蛎鳃和胚胎的染色体片子各1～2张。

（2）牡蛎染色体组型分析结果——数据统计、核型图以及核型模式图。

（3）如何获得清晰的染色体分裂相的片子？

八、参考图谱

图12．1　太平洋牡蛎4～8细胞期胚胎的中期细胞分裂相

图12．2　二倍体太平洋牡蛎的核型图

图12．3　二倍体太平洋牡蛎的核型模式图