实验二十二 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测
细胞在受到射线、化学物质等有害因素作用后，可产生除细胞核以外的次级核，研究证明，其化学成分与细胞主核相同，因其体积很小，故称微核。多数学者认为细胞通过两种机制产生微核：①染色体断裂剂导致染色体断裂，产生的无着丝粒断片或环，不能进入子细胞核，被包含在子细胞的胞质内，单独形成一个或几个规则的微核。②纺锤丝毒性药物（如秋水仙素等）能抑制纺锤丝的形成，破坏染色体和纺锤体的连接，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端，染色单体行动滞后，不能进入子细胞的主核，而形成了一组微核，体积往往略大于一般典型的微核。由于微核的产生与染色体和DNA损伤有较大关系，故常将微核的检出率作为DNA损伤的一种指标。
微核试验（micronucleus test，MNT）方法可分成两大类：一类是从外周血中分离淋巴细胞，常规涂片即可，称直接法。该法制作简便、快速，适用于大面积的人群普查。但理论上未经分裂的细胞不能形成微核，而连续分裂的细胞中染色体的无着丝粒断片会逐渐丢失，因此，直接法的微核检出率低，敏感性较差，在准确反映染色体损伤方面不宜采用。另一类是培养法，即将细胞经体外培养后再制片。因微核在细胞周期各个阶段均可形成，故该法微核检出率高，敏感性较直接法强，而且制备的标本胞质完整、染色清晰。
一、实验目的
熟悉微核实验的基本原理以及在DNA损伤中的检出意义。
二、实验原理
多种环境化学物质可导致细胞中染色体或纺锤体的损伤，产生的染色单体或染色体无着丝粒断片在细胞分裂末期滞留在子细胞胞质中，形成微核。环磷酰胺因具有显著的诱变作用，而常被用作骨髓微核试验的阳性对照物。本实验用环磷酰胺作诱导剂，促使细胞中染色体断裂，产生微核。
骨髓嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）中主核已排出，微核经Giemsa染色后色泽鲜红，胞质内含有核糖体，被染成淡灰蓝色，微核与胞质形成鲜明的对比，易于鉴别；而成熟红细胞中的核糖体已溶解，被染成淡橘红色，与PCE区别明显。
三、实验用品
（1）材料：2～3月龄、体重18～22g的健康小鼠。
（2）仪器与器材：1ml注射器、解剖器械、低速离心机、5ml离心管、毛细吸管、载玻片、染色缸、显微镜、计数器。
（3）试剂：生理盐水、Giemsa原液、磷酸盐缓冲液（pH 6.8）、甲醇、环磷酰胺。
四、实验内容
（1）染毒：小鼠腹腔注射环磷酰胺0.5mg/10g体重。同时以生理盐水做对照。
（2）取材：30h后，以颈椎脱臼法处死小鼠，取两腿股骨，剔净肌肉，擦去附着在上面的血污，剪去两端骨头，暴露骨髓腔，用注射器吸取1ml生理盐水，将针头插入骨髓腔上段冲洗，用试管接收冲洗液，即成骨髓细胞悬液。
（3）离心：1 000r/min离心5min，弃上清液，留少许液体，用毛细吸管将细胞团块轻轻吹打均匀。
（4）涂片：混匀后的液体滴1滴于载玻片上，涂片，自然干燥。
（5）固定：玻片标本置于甲醇溶液中固定5～10min，晾干。
（6）染色：Giemsa原液用磷酸缓冲液按1∶10的比例稀释，染色10min。自来水轻轻冲去多余染液，晾干，镜检。先在低倍镜下选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区域，再转到油镜下，观察嗜多染红细胞的微核。
典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，偶尔呈肾形、马蹄形或环形，嗜色性与主核一致，直径通常为红细胞的1/20～1/5。每张玻片标本计数100～200个嗜多染红细胞，按“‰”计算微核的出现率。微核计数以“细胞”为单位，即1个细胞中出现2个或2个以上微核时，只按“1”计算。
给药组与对照组微核率有明显的剂量反应关系并有显著性差异（P＜0.01）时，可认为是阳性结果。说明该物质能引起染色体断裂，是一种DNA断裂剂。如无剂量反应关系时，则须进行重复试验，结果能重复者可确定为阳性，否则为阴性。实验结果为阴性时，下结论要慎重。
五、注意事项
（1）小鼠股骨较短、细，剪股骨头时，应尽量保持股骨中段的完整。
（2）染液浓度、pH、染色时间等多种因素可影响染色效果，因此，计数前必须仔细观察PCE和成熟红细胞的差别，正确辨认。
（3）室温较低时，可适当延长染色时间。
（4）正确掌握微核的形态特征，避免假阳性。PCE中的RNA颗粒、含酸性多糖的颗粒以及一些附着的染料颗粒等，经Giemsa染色后与微核颜色一致，易与微核混淆，应注意辨别。
（5）制片后，以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
（6）出现阴性结果的主要原因
1）被筛选的化学物质不引起微核率增高。
2）制片时间不当：有些断裂剂能延迟红细胞的分裂和成熟，使出现微核的高峰时间推迟，因此，应根据细胞周期和不同物质的作用特点，定取材时间。可先做预试，一般为30h。
3）剂量过高或过低：各种化学物质的理化性质、体内代谢途径不同，应根据实验需要，根据药物的特点选择给药途径。例如，骨髓实验需短时间内达到有效浓度，应选用腹腔注射或口服用药。
六、作业与思考题
每位学生观察并计数50～100个嗜多染红细胞中的微核细胞，以小组为单位，统计数据，得出微核细胞的千分率，并将结果写成实验报告。
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