染色体的制备与分析

染色体制备常用方法包括直接法和短期培养法。直接法是指标本采集后不经培养立即收获细胞制片，短期培养法是指标本经有核细胞计数后按一定的细胞密度［（1～2）×106/ml］接种到培养基内，经过24h或48h培养后再收获细胞制片。目前认为应用细胞短期培养法能揭示更多具有染色体异常的细胞，其制备与分析大致包括以下几个步骤：取材、接种、培养、收获、制片、显带、染色及核型分析。

（一）取材

无菌操作抽取患者骨髓2～3ml，注入取材瓶（含肝素的2ml 1640培养基）中，轻轻混匀，4h内接种培养。当外周血白细胞数＞15×109/L，幼稚细胞＞70%时，也可用静脉血代替骨髓进行培养，但应尽可能取骨髓标本。

（二）接种

标本经有核细胞计数后按（1～2）×106/ml的最终细胞密度计算接种细胞量，接种到培养瓶（含4ml 1640培养基）中，接种两瓶，并贴好标签。

（三）培养

将接种好的培养瓶放入37℃孵育箱中培养24h或48h后，每瓶各加入秋水仙碱（秋水仙素）（5μg/ml）150μl，轻轻摇匀，37℃培养1h。

秋水仙碱系一种生物碱，其作用有：①破坏纺锤体，使细胞分裂停止在中期；②使染色单体收缩，形态典型，宜于观察和分析。

（四）收获

1.低渗 将培养瓶取出，标本分别移入离心管中，离心（转速1 000r/min，以下离心条件相同）10min后，弃上清（若沉淀过多应分管），加入37℃预温好的低渗液（0.075MKCl:1%枸橼酸钠＝4:1）至8ml左右，用吸管轻轻打匀后置37℃，等待35min。

低渗液处理细胞是为了使制片时染色体获得满意的分散。

2.预固定 低渗后每管立即加固定液（甲醇:冰醋酸＝3:1，需现用现配）1ml，用吸管充分打匀（上下吹打30次左右，尽量避免产生气泡），离心10min后弃上清，合管。

固定液处理细胞：一是为了防止其变质；二是由于抽提了与染色体结合的组蛋白，显带后能产生清晰的带型。

3.固定 加入固定液6～8ml，混匀，室温固定大于30min后，离心10min弃上清。

4.二次固定 加入固定液6～8ml，混匀，室温固定大于15min后，离心10min弃上清。

5.三次固定 加入固定液6～8ml，混匀，置4℃冰箱过夜（标本经上述处理后可在4℃冰箱存放较长时间）。

（五）制片

采用热膨胀法滴片使细胞膜破裂，染色体分散。将玻片浸泡于95%乙醇中，滴片时取出重新浸泡于20%乙醇中，然后用吸管吸取细胞悬液（经新鲜固定液固定，细胞浓度大致呈毛玻璃状）从l0cm高处滴下，每片2～3滴，立即过火可出现小火苗，然后在火焰上方来回通过数次即可，置于空气中待干燥。一般每份标本制片3～5张。

（六）显带

常用的染色体显带技术有以下4种：Q带、G带、R带和C带。国内应用较广的是G带和R带技术，两者带型相反，各有优势。G带的长处是带纹细致，因而解象力较强；其短处是多数染色体末端呈浅带，不利于该区异常的识别，其次G带对标本中分裂象的数量和质量的要求较高，以致分裂象相对贫乏且染色体质量较差的白血病和实体瘤标本常不易获得高质量的带型。R带带型与G带正好相反，即前者的阳性带相当于后者的阴性带，而前者的阴性带则相当于后者的阳性带，而且除Y染色体外，其余染色体末端均呈深带。因此R带不但可代替G带作为常规显带技术应用，而且还有胜过G带之处：R带作为G带的互补带，有助于确定位于G带阴性区的染色体重排断裂点；其方法简便，重复性好，带型清晰，易于识别，标本可成批显带，对于分裂象量少质差的肿瘤细胞其显带成功率明显高于G带；R带对揭示涉及染色体末端的缺失和易位特别有价值，因此尤其适用于肿瘤染色体的检查。

R显带方法：将R显带液（Earles溶液）倒入立式染缸中，加盖后至水浴箱中加热至87.5℃，恒温后将干燥好的玻片标本放入R显带液中温育。1h后，每隔5～10min取出一张玻片，流水冲洗，直至全部取出。

Earles溶液：氯化钠6.8g，氯化钾0.4g，硫酸镁0.2g，葡萄糖1.0g，磷酸二氢钠0.164g，磷酸氢二钠0.2g，酚红0.01g，氯化钙0.2g，三蒸水1 000ml。充分混匀后调pH到6.5，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，分装后置4℃冰箱保存备用。

（七）Giemsa染色

用磷酸缓冲液（pH6.8或7.4）稀释Giemsa原液配制成10%溶液（应新鲜配制），将显带后的标本染色大约10min后，流水冲洗干净，待干燥后分析。

（八）核型分析

染色体的核型分析包括镜下分析、照相分析和电脑分析。最常用也是最基本的方法是显微镜下分析。照相分析作为辅助方法，尤其是遇到比较复杂的染色体核型时尤为有用。若有条件也可用电脑分析，但当出现一些错误排列时，仍需要人工识别。染色体分析是一项十分细致的工作，要求检查者有极大的耐心和一定的经验，在分析时应注意以下几点：

1.先用低倍镜按一定的顺序逐个视野寻找可分析的分裂象，再换用油镜进行观察。分析时要遵循随机的原则，避免只挑选清楚的分裂象进行分析，否则可致人为的假阴性结论。因为清楚的分裂象常来自正常细胞，而不清楚的分裂象常来自白血病细胞。

2.油镜下观察1个分裂象时，应先计数染色体的数目，确定有无数目异常，对偶见的多倍体和明显的亚二倍体（少于40条）一般不作计数和分析。然后逐条审视其核型，以检出结构异常。一旦找出异常，往下继续分析时，先计数分裂象的染色体数目，然后重点观察有无前一个分裂象中发现的异常，如此则省时省力。但由于染色体异常有时是复杂的，观察者的注意力也不要只集中于已发现的异常，还要了解有无其他伴随的异常，以免造成遗漏。

3.核型分析时既要大胆怀疑，又要慎作结论，就是说在未发现异常时，要用怀疑的目光观察各条染色体；一旦发现异常，应小心鉴定，以免作出错误判断。前者提高敏感性，后者保证准确性，两者相辅相成。如发现l条染色体的形态有可疑异常时，应尽量用扭曲、折叠、拉长、浓缩和断裂等因素所致来解释。只有当上述因素都除外后方能确定为异常。带型才是识别染色体的重要依据。复杂异常最好采用绘图核型分析。

4.发现1条异常染色体而同时又缺少另1条正常染色体时，该异常染色体首先应被看作是来自缺少的那条染色体的重排所致。只有当不能以此解释时才需寻找其他来源或可能。

5.通常要求分析15～20个中期分裂象。

6.核型分析时还可根据骨髓片提供的初步诊断，有针对性地重点排查该种疾病的常见异常，从而收到事半功倍的效果，但另一方面也要注意不可受细胞学诊断的束缚或误导。