动物克隆技术及其应用前景

·　克隆技术在畜牧业种畜生产、医学研究和濒危动物保护等方面的应用价值越来越明显。本文综合介绍了动物克隆技术的概念、发展史、基本程序、最新研究进展和应用前景。

动物克隆技术及其应用前景

张秀陶⁽¹⁾　罗旭远⁽²⁾

克隆技术在畜牧业种畜生产、医学研究和濒危动物保护等方面的应用价值越来越明显，人们对克隆的未来充满了信心，但克隆技术在理论和实践上都不完全成熟，在克隆过程中还存在很多亟待突破的难关。根据最新资料，本文谨对动物克隆技术的概念、发展史、基本程序和应用前景作一简单介绍。

一、克隆技术的概念

（一）克隆的定义和分类

“克隆”音译于希腊语“clone”，原意为插枝，是无性繁殖的意思。在自然界中，无性繁殖方式普遍存在于原生动物的分裂繁殖、尾索动物的出芽生殖等，但对于已经有性别分化的高等动物，则要经过精子和卵子的受精作用进行有性繁殖。动物克隆（cloning）是指动物不经过有性繁殖而产生与亲本遗传完全相同的后代。克隆动物的方法有胚胎克隆和体细胞克隆，后者被认为是真正意义上的克隆。

胚胎克隆，即采用较为简单的酶处理和机械分离法，将2至32细胞期胚胎的卵裂球分离，或将桑椹胚至囊胚期的早期胚胎进行分割，从而得到来自同卵的有相同遗传的后代。胚胎克隆的操作方法较为简便，对实验室设备的要求相对低而成功率相对高些，是一条获取同卵孪生实验动物的有效途径，也是繁殖家畜优良品种的方法之一。

体细胞克隆，即通过核移植技术，用胚胎干细胞或体细胞的细胞核作供体，移入去核的卵母细胞中，使供体核在卵母细胞的胞质中重新编程，并将重组的胚胎再植入代孕母体中发育成新个体的过程。根据供体细胞和受体卵母细胞来源的不同，体细胞克隆又分为同种体细胞克隆和异种体细胞克隆。

（二）动物克隆的发展史

早在1938年，德国胚胎学家汉斯·施佩曼建议用成年动物体细胞的细胞核，植入未受精卵子的方法来实现动物的“无性繁殖”，预言了高等动物无性繁殖的可能性,并通过蝾螈胚胎分割实验证明了蝾螈未分化的卵裂球（细胞）具有发育的全能性。

1952年，Briggs和King将蛙的囊胚细胞核移植到去核的卵母细胞中，经正常卵裂发育成蝌蚪。1962年，牛津大学发育生物学家约翰·戈登教授将已分化的蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核的蛙卵中，结果产生了具有生殖能力的蛙，证明了蝌蚪的体细胞具有全能性。20世纪60～70年代两栖类、鱼类也相继克隆成功。我国实验胚胎学家童第周教授于1965年完成了金鱼核移植并获得成功。

1984年，丹麦科学家斯丁·维拉德森成功地利用胚胎细胞的细胞核，取代未受精的卵细胞核产生出一只绵羊。这是首例通过胚胎细胞核移植技术繁殖出的哺乳动物。随后，包括我国在内的世界许多国家的科学家们，先后利用胚胎细胞作为核供体，克隆出小鼠、兔子、山羊、牛、猪等哺乳动物。

1993年，美国Michele M．Sims和Neal L．First从培养的囊胚内细胞团细胞克隆出4头小牛，这是首例以培养的细胞作为供体进行的核移植，提示可以通过转基因培养的细胞作为核供体生产转基因克隆动物。A．E．Sahnieke等在1997年利用转基因胎羊纤维细胞克隆出含人凝血因子Ⅸ基因的转基因绵羊。

1996年，英国罗斯林研究所Wilmut等用成年绵羊乳腺细胞作为核供体，克隆出了世界上第一例体细胞克隆的绵羊——“多莉”，证明了高度分化的成年动物的体细胞可以在适当条件下去分化，重新程序化，恢复全能性。很快，其他实验室分别在牛、山羊和小鼠上证明了这一点。1998年，美国夏威夷大学Wakayama等用直接注射法将卵丘细胞注入到去核卵母细胞中，克隆出三代共50只小鼠，并使克隆的总效率提高到2％。1998年，Kato等用牛的卵丘细胞和输卵管上皮细胞克隆出8头牛犊。1999年，Wells等从活体牛卵巢内采得颗粒细胞作为供体，获得10头克隆牛。2000年，Oikawa等从20岁的日本黑牛体内获得颗粒细胞，经传代培养、血清饥饿培养后作为供核，获得2头犊牛。体细胞克隆山羊和猪的研究也分别由Baguis等于1999年和Zrina等于2000年取得成功。

2002年1月，我国首批用成年体细胞克隆的高产奶牛和优质肉用黄牛出生。2002年西北农林科技大学用成年动物的体细胞克隆出山羊，2003年陈大元课题组成功地克隆出了一批良种奶牛，2004年中国农业大学李宁等成批地获得体细胞克隆牛。

上述文献资料表明，哺乳动物体细胞克隆的成功使克隆技术进入了一个新的发展阶段。

二、动物克隆的理论依据和技术路线

（一）动物克隆所依赖的理论

1902年哈布兰德提出了细胞潜在全能性学说，即任何一个处于细胞分化临界期之前的细胞，只要处于合适的条件下，既可以发育为完整的生物体，也可以发育为任何组织、器官，还可分化为任何成熟细胞。

随后的很多实验都已经证明，在动物胚胎发育的早期阶段，每一个胚胎细胞都具有这种“全能性”，只是随着胚胎的继续生长发育，胚胎细胞渐渐失去了“全能性”而开始功能特化，此过程叫做分化。“多莉”的出生恰好证明，高度分化的体细胞在适当条件下，是可以去分化，恢复“全能性”的。去分化过程伴随着基因组水平的后生重编程，包括与染色质相关的连接组蛋白、转录因子的重构，基因组甲基化变化，组蛋白组装及核小体形成等不同形式。

（二）克隆技术的基本程序

受体细胞选取及去核。通常选择的受体细胞有卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中以卵母细胞作受体最为普遍。一般采用盲吸法、半卵法或者功能性去核法去除其细胞核。

供体细胞选取及取核。可供选择的供体细胞有早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞三类。一般通过饥饿法来诱使供体细胞进入静止期，促使核内染色质改变，在显微操作下取出含有遗传物质的细胞核。

重构胚胎。将供体细胞核移入去核的受体细胞的卵周隙中，在微电流刺激下使重构胚胎进行融合。

重构胚胎移植。重构胚胎经过体外培养至完全恢复其“全能性”，再通过常规胚胎移植技术，将其移植到代孕母体的子宫或输卵管内，使母体妊娠并分娩出克隆个体。

三、动物克隆技术存在的问题

虽然动物体细胞克隆技术已经出现了近十年，但是在理论和技术上都还没有成熟，存在着许多尚需解决的问题。

(一)成功率低

尽管也有少数成功率较高的报道，但目前公认的体细胞克隆成功率在0.1％～2％。克隆胚胎移植后的出生率平均不到10％，胎儿异常、流产和围产期死亡率极高，使得该技术与实际应用和大批量生产尚有一定的距离。

图1　体细胞克隆基本技术环节图

（二）供体核与受体胞质细胞周期同步的问题

关于血清饥饿G₀/G₁期细胞作为核供体的优越性存在争议。一般认为，成体细胞因对接触抑制敏感性高和细胞周期长，故无需饥饿也多处在G₁期。而胎儿细胞则必须饥饿才能进入静止期。除了S期以外，其他各时期细胞均可作为核供体，对于受体细胞来说，去核的MⅡ期卵母细胞经过激活后，可以接受各个时期的核供体。处于G₁期的供体核在与MⅡ期去核卵母细胞结合后，早期胚胎的卵裂率、囊胚发育率和产仔率都明显高于M期、S期和G₂期。

（三）线粒体来源的问题

在核移植时，无论是直接注射还是细胞融合，供体核都会带有一部分细胞质，从而也把供体细胞的线粒体带入了受体细胞内，由于线粒体含有遗传物质DNA，因此，核移植克隆动物实际上是一种遗传嵌合体：nDNA来源于核供体细胞，而线粒体DNA则至少部分来自受体胞质。试验结果却是克隆绵羊（多莉等10只）的线粒体DNA完全来源于受体胞质，而克隆牛的线粒体为杂合型的，既有供核细胞来的，也有受体胞质来的，还有完全来源于受体胞质的。

（四）端粒的问题

端粒是染色体端部特化部分，能防止染色体黏着。端粒由高度重复的短序列核苷酸组成，具高度保守性。细胞每复制一次端粒核苷酸就减少50～100bp。端粒复制要靠端粒酶。正常细胞缺乏此酶，故端粒随细胞分裂而变短，细胞衰老，但生殖细胞和癌细胞则都有此酶，因此不衰老。Shiels等发现，Dolly等3只克隆羊的端粒限制性片段平均长度都比同龄对照羊短。然而，Betts等发现，牛克隆胚胎最初接受了供核细胞在体内、外所获得的基因组修饰，端粒缩短，但在后来的发育过程中又擦除了这些修饰，端粒长度恢复。因此，关于克隆动物端粒酶活性是否恢复的研究结果是趋于肯定的。

（五）X染色体灭活的问题

雌雄哺乳动物的基因剂量补偿是通过灭活雌性动物的一条X染色体来实现的。正常情况下，着床前胚胎的两条X染色体都活动。后来，上胚层中X染色体随机灭活，而滋养层细胞则专门灭活父系X染色体。Eggan等发现，小鼠克隆胚胎胚体的X染色体灭活方式是随机的，即体细胞中活动X染色体(Xa)与灭活X染色体(Xi)之不同的标志在核移植后被擦除了，重新发生随机灭活。但克隆胚的滋养层则保留了原有体细胞的X染色体灭活状态。Xue等发现，死亡克隆牛X-连锁基因在同一器官中有的表达，有的不表达，说明X染色体灭活不完全。死亡克隆胎盘X染色体随机灭活，但活克隆为父系X染色体灭活。

（六）克隆胚胎某些基因的再程序化异常

DNA甲基化是基因组后生遗传修饰和基因组功能调节的主要手段。Dean等发现，牛正常胚胎在8-细胞前，甲基化程度进一步下降，到16-细胞时又开始再甲基化。克隆1-细胞胚胎的甲基化程度下降，但以后并不进一步去甲基化，而是提前发生再甲基化。在克隆牛的桑椹胚和囊胚中，几个重复和单一序列的甲基化水平较正常的胚胎高得多，而接近于供核胎儿成纤维细胞的甲基化水平，使得某些胚胎基因不能再激活。这说明，大多数移植前的克隆胚胎核的再程序化是不完全的，特别是去甲基化不充分。如要有效的克隆，很重要的一方面是甲基化被反转而又能重新被建立，然而去甲基化及甲基化的重新建立的具体机制还有待深入研究。

四、动物克隆技术的应用前景

（一）促进畜牧业发展

克隆技术发展的最直接的受益者是畜牧业。畜牧业的效率主要来自动物个体生产性能和群体的繁殖性能，而动物的生产性能和繁殖性能又由它们的遗传特性决定。将动物克隆与传统的育种技术相结合，快速改善种群遗传结构，大量培育高产低耗、优质抗逆新品种，是畜牧育种工作者面对的最重要的课题之一。我国首批出生的体细胞克隆牛就是以牛耳壳皮肤成纤维细胞克隆出高产奶牛和优质肉用黄牛的。

（二）实现濒危动物的保护

异种克隆技术的出现，对珍稀物种和仅存单一性别的濒危动物来说，是其种族得以延续的唯一希望。如新西兰仅存的一头珍稀牛的克隆成功，说明异种克隆并非不可能。在我国，被国际组织列为世界20大濒危灭绝物种之一的大熊猫，以及现存数量也不多的金丝猴、东北虎、扬子鳄等国宝级保护动物，均有希望通过动物克隆技术得到挽救和保护。

（三）开发活体“动物制药工厂”

转基因技术和动物克隆技术相结合，将动物个体开发成为活体“动物制药工厂”，生产预期的药物蛋白。目前，已经成功实现转基因克隆动物生产药用蛋白。DNX公司（1988）通过将人的血红蛋白基因转入猪细胞，实现转基因猪生产人血红蛋白。Kerr（1996）等在转基因小鼠的尿液中表达出人的生长激素。Wilmut研究小组成功获得转基因克隆羊的乳腺高表达凝血因子Ⅸ。如果把转基因已经成功的动物再进行动物克隆，等于又克隆出一个“动物制药工厂”。因此，克隆技术在生物制药方面将大有可为。

（四）发展治疗性克隆

胚胎干细胞是一种多能性的细胞，它能无限制地增殖，并能分化成有机体的所有细胞。因此它可用来修补组织和器官。人类的许多疾病是由于细胞受损和死亡而引起细胞功能的消失，例如帕金森氏病、皮肤烧伤、心肌梗死、糖尿病、肾衰竭、脑外伤、白血病及各种血液病等。如果直接利用病人的体细胞，通过克隆技术，构建囊胚，然后用内细胞团培养成胚胎干细胞，然后再诱导分化，使其变成所需要的细胞用来治疗，这样细胞移植或器官移植就不会引起排异。

总之，克隆技术在畜牧业种畜生产、濒危动物保护和医学研究等方面的应用价值越来越明显，人们对克隆的未来充满了信心，但克隆技术的发展与完善过程将是长期的、艰巨的，相信一代又一代的科学家们会用智慧与耐心来迎接每一项考验和挑战。

【注释】

(1)宁夏农林科学院畜牧兽医研究所

(2)宁夏海原县畜牧局