动物细胞的传代培养

任务2　动物细胞的传代培养

原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖，这时需要进行分离培养，否则会因细胞生存空间不足或密度过大、营养障碍而影响生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代，进行一次分离再培养称为传一代。

一、原代培养物需要换液和传代的指标

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞继续生长，同时增加细胞数量，就必须进行传代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。

初代培养的首次传代是很重要的，是建立细胞系的关键时期。在首次传代时，一般要特别注意以下几点。

（1）在细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面之前，不要急于传代。

（2）原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见。传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要注意观察，根据需要及时进行处理，并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外，早期传代的培养细胞与已经建系的培养细胞相比消化时间更长。

（3）首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。

（4）首次传代培养时的pH值不能高，宁可偏低一些。此外，小牛血清浓度可适当加大至15%～20%。

二、细胞传代方法

根据不同细胞采取不同的培养细胞传代方法。悬浮生长的细胞可以直接加入等量新鲜培养基后直接吹打或离心分离后传代，或自然沉降后吸去上清液，再吹打传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁生长的细胞用直接吹打或硅胶软刮的刮除法传代。

细胞传代培养时常用的酶为胰蛋白酶，它可以破坏细胞与细胞、细胞与培养瓶之间的细胞连接或接触，从而使它们之间的连接减弱或完全消失。经胰蛋白酶处理后的贴壁细胞在外力（如吹打）的作用下可以分散成单个细胞，再经稀释和接种就可以为细胞生长提供足够的营养和空间，达到细胞传代培养的目的。

（一）操作方法

1.贴壁细胞的消化法传代（以25mL培养瓶为例）

（1）吸去或倒掉瓶内旧培养液。

（2）向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA的混合液），轻轻摇动培养瓶，使消化液铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，吸去或倒掉消化液后再加1～2mL新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤，直接加1～2mL消化液进行消化，但要注意尽量减少消化液的剩余量，因为消化液过多对细胞有损伤，同时也需要较多的含血清培养液去中和。

（3）消化在25℃以上（最好在37℃）进行，消化2～5min后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现细胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化。

（4）如仅用胰蛋白酶，可直接加少许含血清的培养液终止消化。如用EDTA消化，需加Hank′s液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留EDTA消化液冲掉，然后加培养液，在这个操作的过程中要十分小心，如果细胞已经脱壁则消化液不能倒掉，以免细胞丢失，要加入Hank′s液或培养液终止消化，吹打收集细胞悬液，离心，漂洗，去除EDTA。

（5）用弯头吸管吸取瓶内培养液，按顺序反复吹打瓶壁细胞，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔，不要用力过猛，同时尽可能不要出现泡沫，以免对细胞造成损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。

（6）计数后，按要求的接种量接种在新的培养瓶内。

贴壁细胞消化法传代如图1-45所示。

2.悬浮细胞的传代

因悬浮细胞生长不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心，收集细胞后传代。

图1-45　贴壁细胞消化法传代

（1）直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后将上清液吸去1／2～2／3，然后用吸管吹打，形成细胞悬液后再传代。

（2）悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800～1000r／min离心5min，然后去掉上清液，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。

部分贴壁生长的细胞，不经消化处理直接吹打也可使贴壁细胞从壁上脱落下来而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如HeLa细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，细胞也有较大数量的丢失，因而绝大部分贴壁生长的细胞需消化后，才能吹打传代。

三、传代细胞的建系和维持

细胞系的的建立和维持是培养工作的重要内容，是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞种子冷冻保存来实现的，但每一个细胞系都有其自身特点，要做好建系和维持需注意以下几个方面。

（1）细胞档案要记录好。如组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长状态，常规病理染色的标本等记录对于保证细胞的正常生长、保持细胞的一致性、观察长期体外培养后细胞特性的改变都有十分重要的意义。

（2）细胞系的传代、换液方法都有自身的规律性。在维持传代时，要注意保持其规律性，这样可以减少传代时细胞密度的频繁增减或换液时间的不确定性而导致的细胞生长特性的改变，给后续的细胞实验带来影响。

（3）多种细胞系维持传代时，要严格遵循操作程序，以防细胞之间交叉污染。对所用的试剂，各系不能交叉，甚至每个细胞系均需有单独实验室。

（4）传代时均应做好记录。培养瓶上要有明显标记，标明细胞系名称和传代的代数及传代时间。

（5）若细胞生长较快，可减去换液步骤，每次均可传代。

（6）每个传代细胞系最好能分成2～3条线，分别传代，同时也可在室温或4℃短期存放一瓶，以防污染、丢失。

四、传代细胞的纯化

传代细胞的纯化一般分为两种，即自然纯化和人工纯化，可根据细胞种类、来源、实验要求和目的选用。

（一）自然纯化

自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然的增殖潜力最后留下生长旺盛的细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞；花费时间长，留下的往往是成纤维细胞；仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来，不断纯化而建立细胞系。

（二）人工纯化

人工纯化是利用人为手段创造对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。主要有以下几种方法。

1.酶消化法

酶消化法是比较常用的纯化方法，不仅对贴壁细胞可行，能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同使两者分开，达到纯化的目的，而且对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也十分有效。

在胰蛋白酶的作用下，由于成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代细胞初次传代和早期传代中两种差别尤为明显，故可采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。

采用常规消化传代方式将0.25%胰蛋白酶注入培养瓶（25mL）内两次，每次加入的量为1mL，来回轻摇1～2次，使胰蛋白酶流过所有细胞表面，然后倒掉。盖好瓶塞，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现成纤维细胞变圆，部分脱落时，立即加入2mL有血清的培养基终止消化。用弯头吸管轻轻吹打成纤维细胞生长区域，吹打时不要用力，也不要吹打上皮细胞生长区域。吹打结束后，再用少量培养基漂洗一遍，然后加入适量培养基于瓶内继续培养，也可重复上述操作再进行一次。隔几日后或下次传代时，再进行上述操作，经过几次处理，就可将成纤维细胞去除或者将两种细胞分开。

2.机械刮除法

原代培养成功后，如果上皮细胞和成纤维细胞分区域混杂生长，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上，可采用机械方法去除不需要的细胞区域而保留需要的细胞区域。

将要纯化细胞的培养瓶在净化室内放在倒置显微镜下进行监视操作。用硅橡胶刮子在不需要生长的细胞区域推划，使细胞悬浮在培养基中，注意不要伤及所需细胞。推划后用培养液冲洗振摇两次后倒掉，即可将培养液加入原瓶继续培养，数日后如发现不需要的细胞又长出，可再进行上述操作，这样反复多次可以纯化细胞。要严格无菌操作，防止污染。

3.反复贴壁法

成纤维细胞与上皮细胞相比贴壁更快，大部分细胞能在短时间（10～30min）内完成附着过程，而上皮细胞（大部分）在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，利用此差别可以纯化细胞。

将细胞悬液接种在一个培养瓶内（最好用无血清培养，此时上皮细胞贴壁更慢），静置20min。在倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加摇动也不浮起时，将细胞悬液导入另一培养瓶中。继续静置培养20min，然后重复上述操作，即可将上皮细胞和成纤维细胞分隔开，在第一瓶和第二瓶以成纤维细胞为主，往后几瓶即以上皮细胞为主，下次传代时再按上述方法处理，就可达到将两者完全分开的目的。

4.培养基限定方法

某些细胞在生长过程中必须存在或去除某种物质，否则将无法生长，而其他细胞与之相反，可以利用这种特性差异来纯化细胞。

知识拓展

美国标准细胞库入库要求

美国标准细胞库入库时要求提供以下信息：①组织来源及其日期、物种、性别、年龄、供体正常或异常健康状态，细胞已传代数等；②培养液和保护剂名称；③冻熔前后细胞接种存活率和生长特性（生长繁殖曲线、分裂指数等）；④培养基种类和名称、血清来源及浓度；⑤细胞形态、类型；⑥二倍体或多倍体、有无标记染色体；⑦污染情况；⑧物种检测、同功酶检测，以证明细胞有无交叉污染；⑨免疫检测；⑩细胞建立者的姓名、检测者的姓名。

Bio-Rad公司推出一款自动化的细胞计数仪

Bio-Rad公司近日推出了一款自动化的细胞计数仪，名为TC10细胞计数仪（TC10automated cell counter）。这款仪器（图1-46）能在30s内准确地提供哺乳动物细胞的总数，代替了用血球计数器在显微镜下手工计数。

图1-46　细胞计数仪

TC10细胞计数仪的计数流程很简单，就是上样—插入—结果。首先将样品上样到计数玻片上，然后将玻片插入TC10细胞计数仪，计数自动开始，30s内总细胞数和活细胞数就显示在屏幕上。仪器对细胞浓度的要求为5×10⁴～1×10⁷个／mL，直径为6～50μm。计数只需要10μL悬浮或重悬的细胞即可，让珍贵样品得以保留。玻片上有两个室（chamber），每次能对2个样品进行计数。TC10细胞计数仪的细胞活力评估也用的是台盼蓝。这种染料被活细胞排斥，能渗入死细胞内。系统在无用户干预的情况下识别台盼蓝的存在，并在30s内提供细胞数目和细胞活力数据。

思考题

1.简述细胞自然纯化的原理。

2.机械刮除法的操作步骤有哪些？

3.悬浮细胞的传代方法是什么？

4.贴壁细胞的传代方法有哪些？

5.试述传代细胞的建系和维持需注意的问题。