发状念珠藻细胞培养与界面培养

发状念珠藻细胞培养与界面培养⁽¹⁾

苏建宇^1，2　贾士儒¹

（1.天津科技大学生物工程学院　天津　300222； 2.宁夏大学生命科学学院　银川　750021）

摘要：在简要说明发状念珠藻及其性质的基础上，对发状念珠藻人工培养现状及本实验室目前开展的发状念珠藻细胞培养的研究进展进行了介绍。由于发状念珠藻藻体难以大规模培养，从藻体中分离发状念珠藻细胞进行液体悬浮培养可以成为获得发状念珠藻细胞并生产发状念珠藻多糖的有效途径，在此基础上进行的发状念珠藻细胞界面培养，则使细胞培养物重建形成发状念珠藻藻体成为可能。

关键词：发状念珠藻；多糖；细胞培养；界面

发状念珠藻（Nostoc flagelliforme）是一种陆生性蓝藻（蓝细菌） ，生长于荒漠—半荒漠草原丘陵裸地，为一种不分枝的丝状体，具有完整结构的发状念珠藻个体称藻体。发状念珠藻主要分布于我国宁夏、甘肃、青海、陕西、新疆、内蒙、河北等省区。发状念珠藻具有固氮能力，在氮素极为缺乏的荒漠草原上发状念珠藻是唯一优势生长的固氮生物，其生长过程中分泌的大量胞外多糖物质，为其他土壤微生物的生长提供了碳源和氮源，是荒漠化土壤中的“先锋生物” 。

1　发状念珠藻的应用价值及培养现状

发状念珠藻长期以来作为一种食用蓝藻，因其发音与“发财”二字谐音而受到广大消费者，尤其是闽粤、港澳台及东南亚地区消费者的青睐，50g商品发状念珠藻售价30～40元人民币。发状念珠藻营养丰富，每100g发状念珠藻中含蛋白质22.8g、钙875mg、镁132mg、铁99.3mg、锌1.67mg、铜0.72mg、磷66mg、硒7.45mg。发状念珠藻蛋白质含量是鸡蛋的1.52倍，分别比黑木耳、地木耳、银耳高出11.84%、4.36%和17.44%。发状念珠藻含18种氨基酸、其中人体必需的8种氨基酸含量高于黑木耳、猴头、香菇等。发状念珠藻中所含叶绿素a、β-胡萝卜素、海胆酮C、藻蓝素和别藻蓝素等具有调节人体代谢，增强机体免疫力的作用。与其恶劣的生活环境相适应，发状念珠藻细胞在生长过程中向细胞外分泌大量的胶质物质，包裹于发状念珠藻细胞及藻丝体外，形成胶质鞘，保护发状念珠藻细胞不受干旱、高温、紫外辐射的危害。胶质物质的主要成分为多糖，这些多糖物质对发状念珠藻抵抗生长地不良环境，保障发状念珠藻的正常生长具有重要的生物学意义。

20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有许多生物活性，且多数对人体无毒，可能成为理想的药物来源。发状念珠藻多糖是一类复合多糖，初步的研究表明，发状念珠藻多糖具有抗肿瘤、抗病毒作用。日本富山医科药科大学从发状念珠藻多糖中分离纯化得到一酸性杂多糖Nostoflan，经实验证实对流感病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等多种具封套的病毒均具有抗病毒活性^[1]。日本微细藻类株式会社开发出以发状念珠藻为主要原料的保健食品“阿拉善” ，市场十分畅销。

发状念珠藻有着特殊的生态环境要求和地理分布，发状念珠藻主要分布在荒漠-半荒漠草原地带，具有嗜光、耐旱、耐温差、嗜钙、嗜碱、耐贫瘠的生态学特性。发状念珠藻生长极为缓慢，据调查，发状念珠藻自然年生长率约为15%左右，自然蕴藏量相当有限，而近年来发状念珠藻价格的上涨使得对发状念珠藻的掠夺性采收加剧，发状念珠藻资源遭受严重破坏，以致濒临枯竭。我国发状念珠藻主要产地之一的宁夏回族自治区，20世纪60年代发状念珠藻生长地面积约360.7万公顷，至80年代中期减少到173.3万公顷，到90年代未已减至不足100万公顷，发状念珠藻的产量则从70年代的每公顷3～7.5kg下降至目前的每公顷约0.1kg^[2]。对发状念珠藻的不合理采收还对发状念珠藻生长地的生态环境造成严重破坏，致使草场退化，荒漠化程度加剧。我国内蒙古自治区因采收发状念珠藻而被完全破坏的草地面积达400万公顷，遭严重破坏的草地1266.67万公顷，每年由于采收发状念珠藻破坏草地所造成的损失高达20.7亿元人民币^[3]。鉴于这一局面，国务院于2000年6月15日发布通知，禁止发状念珠藻的采收、加工和销售，发状念珠藻被列为国家一级重点保护植物，以发状念珠藻为原料的生产因此而无法进行，发状念珠藻多糖作为一种据有良好应用前景的生物活性物质，其开发和生产因没有原料来源而难以开展。解决这一问题的唯一途径是进行发状念珠藻的人工培养。

发状念珠藻人工培养技术的研究已开展了多年，研究工作主要集中在国内。这些研究多利用固体基质对发状念珠藻藻体进行培养或采用大田种植方式对发状念珠藻进行栽培生产，在人工培养条件下，发状念珠藻年生长率已可达到195%^[4，5]，是发状念珠藻自然生长量的30倍以上，但这种对发状念珠藻藻体所进行的人工培养生产面临着生产周期长、成本高、生产过程中可能因遭受自然灾害而造成巨大损失等不利因素，而且在禁止野生发状念珠藻的采收后难以获得生产所需的原种发状念珠藻，发状念珠藻的人工培养生产始终无法真正开展。

2　发状念珠藻细胞液体悬浮培养

发状念珠藻藻体是一胶质复合体，藻体内有许多由念珠状细胞构成的藻丝体（filaments） ，其数目为数百根至数千根。这些藻丝体平行纵向排列，由藻细胞分泌产生的胶质物质将其包被构成发状念珠藻藻体。发状念珠藻藻体的生长建立在其胶质鞘中藻丝体长度和数量增加的基础上，而藻丝体长度和数量增加是藻细胞分裂繁殖的结果。在一个完整的发状念珠藻藻体中，发状念珠藻细胞在生长过程中分泌大量多糖物质形成胶质鞘包裹于藻丝体外，胶质鞘是发状念珠藻对干旱恶劣环境的适应，但发状念珠藻细胞将光合作用产物大量的分泌到细胞外，用于自身生长的能源和碳源不足，因而细胞生长十分缓慢。因此，发状念珠藻人工培养的关键是改变发状念珠藻固有的生物学特性，使发状念珠藻细胞生长过程中少产生或不产生胞外分泌物，将碳源和能量集中用于细胞生长，从而实现发状念珠藻的快速生长。但发状念珠藻细胞胞外分泌物的减少会使发状念珠藻藻体胶质鞘结构遭到破坏，在目前采用的固态培养方式下，发状念珠藻细胞会由于丧失了胶质鞘的保护而无法正常生长，最终死亡。因此，必须改变传统的发状念珠藻培养模式，开发新型培养方式。

发状念珠藻是多细胞蓝藻，从发状念珠藻藻体中分离发状念珠藻细胞，使其在液体培养基中悬浮生长，借鉴水生藻类的培养工艺，以液体培养的方式进行发状念珠藻细胞的大规模培养，可以实现从细胞培养液中直接提取发状念珠藻多糖等生物活性物质，发状念珠藻细胞培养液还可直接作为生产功能性食品或药物的原料，从而改变只能从发状念珠藻藻体中提取发状念珠藻多糖的现状，不消耗野生发状念珠藻资源，不破坏发状念珠藻生长地生态环境。通过对培养条件的优化研究，发状念珠藻细胞培养周期缩短至20d，细胞产量达7～9g／L，发状念珠藻多糖产量达60.6mg／L^[6]。

发状念珠藻细胞培养以单离的发状念珠藻细胞和藻丝为培养对象，在液体悬浮培养条件下培养物以单细胞、短藻丝或细胞群体的状态存在，不形成具有完整结构的发状念珠藻藻体，而传统上是以发状念珠藻藻体作为商品发状念珠藻，因此单纯采用细胞培养技术尽管可以生产发状念珠藻多糖等生物活性物质，但无法解决商品发状念珠藻的生产问题。加之发状念珠藻是荒漠化草原上唯一优势生长的固氮生物，在我国西部的环境治理和生态恢复方面具有不可替代的作用，因此应进一步开发由大量发状念珠藻细胞重建形成发状念珠藻藻体的技术方法。

3　界面与发状念珠藻生长

界面是指两个物体相态接触的分界层，通常厚度只有零点几纳米到几纳米。地球上的大地、海洋和大气之间存在界面，一切有形的实体都为界面所包裹。界面是独立存在的，并且具有自身的特性，但和两边相态有依存关系。

生物在界面上生长繁殖是自然界广泛存在的客观现象。日常生活中，人们可以看到微生物吸附在固体表面，形成黏性、光滑的表面。也可以观察到在墙壁、金属材料、玻璃、黏土、岩石、纤维等物体上吸着微生物，并且使之呈现出特定的形状。

自然状态下发状念珠藻匍匐于地表生长，是一种典型的界面生长。实验中发现，不同基质上生长的发状念珠藻在形态、细胞亚显微结构、胞外分泌物的产生及生长速度等方面均表现出明显的差异，表明基质性质对发状念珠藻及其生长具有重要影响。同时，发状念珠藻生长过程中对水分、营养物质的吸收及代谢产物的分泌必然也会对基质的理化性质产生影响，基质与发状念珠藻之间的相互作用决定了发状念珠藻的生长状态，因此，仅仅从温度、pH、营养物质等环境因素出发研究发状念珠藻的生长难以从根本上阐明发状念珠藻的生长机制并进而制定有效的培养方法。

如果将界面的吸附等作用看成是一种独特的界面力的话，这种界面力对于离子、大分子和胶体在界面附近的分布具有重要影响。此时，界面相当于富集潜在营养物质的部位，对生物的分布、生长、演替和效应发生着显著的影响。在发状念珠藻生长过程中界面性质对其在基质上的吸附以及生长、代谢均产生影响，由于发状念珠藻藻体的形成建立在细胞产生大量分泌物包裹细胞及藻丝体的基础上，而液体培养条件下即使通过改变培养条件促使发状念珠藻细胞产生分泌物，这些分泌物通常也是扩散到液体培养基中而不是粘附于细胞外，因此悬浮生长的发状念珠藻细胞难以聚集形成藻体。实验中虽然观察到在静置培养条件下部分发状念珠藻细胞发生聚集并形成藻体形态，但发生率低且周期长，并不具备生产意义。必须给发状念珠藻细胞提供一个可吸附的载体，并使其大量分泌积累胶质物质，才有可能实现从发状念珠藻细胞到发状念珠藻藻体的重建。对于细胞培养所得到的大量发状念珠藻细胞是否能在某种载体上生长并使其分泌的胶质物质包被其细胞恢复藻体形态，界面性质将起到关键作用，因此必须从界面的角度去研究发状念珠藻及其细胞的生长，建立一种新的生物培养方法，即界面培养。

4　发状念珠藻界面培养

与传统固态培养不同，界面培养过程中微生物可能不是直接生长在基质上而是生长在一个特定的载体上，载体的功能是给微生物的生长提供一个吸附的表面并富集来自于基质营养物质。界面培养可以是一个固态培养体系，也可以是一个液态培养体系。界面培养不仅对宏观培养条件进行控制，更重要的是对与生物体相接触的载体表面，即界面的性质进行控制，使对生物生长有最直接作用的外部微环境达到最优，从而使微生物的生长或代谢产物的积累达到最佳水平。由于界面具有富集营养物质的作用，因此采用界面培养还可提高微生物对营养物质的利用率，从而在相对贫瘠的培养基上生长。

发状念珠藻界面培养研究是在充分了解发状念珠藻生物学特性的基础上，针对发状念珠藻生长过程中对附着基质的依赖性，进行不同界面材料（沙粒、塑料颗粒、珍珠岩、膜材料等）对发状念珠藻生长、代谢与形态影响的研究，通过考察发状念珠藻对不同基质附着依赖性的差别，确定适于进行发状念珠藻界面培养的载体。通过界面性质（界面材料的颗粒直径、形状等或孔径、表面张力、膜面积、静电场、磁场等）对发状念珠藻生长、代谢、形态变化以及基质附着依赖性强度等影响的研究，探讨影响发状念珠藻附着生长的主要因素和界面性质影响发状念珠藻附着生长的主要原因，确定发状念珠藻界面培养的关键技术参数。

在上述研究的基础上，将液体培养获得的大量发状念珠藻细胞，转接到所确定的载体上进行气—固界面培养。试验结果表明，在固态基质表面发状念珠藻细胞生长状态与在液体培养基中有明显区别，接种后发状念珠藻细胞以接种点为中心生长，日生长率约为3%～5%左右。培养过程中细胞胞外分泌物增加，在细胞外形成致密的胶质结构，与野生发状念珠藻接近，且培养物逐渐表现出对于干旱环境强烈的适应性，干燥后呈黑色，与野生发状念珠藻相同。

通过发状念珠藻细胞培养和界面培养的研究，将可以解决发状念珠藻生长缓慢、只能室外大田式生产、生产效率低等目前制约发状念珠藻人工培养开展的关键因素，实现发状念珠藻及其生物活性物质的工厂化生产。

参考文献：

[1] Kenji Kanekiyo，Jung-Bum Lee，Kyoko Hayashi，et. Isolation of an antiviral polysaccharide，Nostflan，from a terrestrial cyanobacterium，Nostoc flagelliforme. J. Nat. Prod，2005，68: 1037～1041

[2]戴治稼.发状念珠藻研究的回顾.宁夏大学学报（自然科学版） ，1992，13 （1） : 71～76

[3]由亚男.发状念珠藻贸易对内蒙古草地生态环境的影响及政策建议.干旱区地理，2000，23（3） :279～ 283

[4]苏建宇.发状念珠藻人工培养研究.天津轻工业学院硕士学位论文，2002

[5] Gao K et.Chinese studies on the edible blue-green alga-Nostoc flagelliforme:a review.Applied Phycology，1998，（10） :37～49

[6]白雪娟.发状念珠藻多糖及其制品的初步研究.天津科技大学硕士学位论文，2005

【注释】

(1)基金项目：国家自然科学基金（No.20376061） ，天津市科技发展计划重点基金（No.043801611）