发状念珠藻细胞光合自养和混合营养培养的比较

发状念珠藻细胞光合自养和混合营养培养的比较⁽¹⁾

于海峰　林永贤　于娓娉　贾士儒

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：采用摇瓶进行了发状念珠藻细胞的混合营养培养，并与其光合自养培养进行了比较。两种营养方式下，发状念珠藻细胞的光饱和点基本相同，都在40～45 umol.m^-2s^-1。当光照强度为60 umol.m^-2s^-1，初始葡萄糖浓度为3.95gL^-1时，发状念珠藻混合营养培养8d后，生物量为2.27 gL^-1，叶绿素浓度为5.57mgL^-1胞外多糖产量为239.93mgL^-1，分别为同期光合自养培养的3.98倍、2.32倍和5.9倍。这表明混合营养培养对提高发装念珠藻细胞培养的密度、光合色素合成以及胞外多糖产量方面都有显著作用。

关键词：发状念珠藻细胞；混合营养；光合自养

引言

发状念珠藻是一种食用蓝藻，因其发音与"发财"二字谐音而受到广大消费者，尤其是闽粤、港澳台及东南亚地区消费者的青睐。发状念珠藻营养丰富，每100g发状念珠藻中含蛋白质22.8g、钙875mg、镁132mg、铁99.3mg、锌1.67mg、铜0.72mg、磷66mg、硒7.45mg。发状念珠藻含18种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸含量高于黑木耳、猴头、香菇等^[1，2]，其食用安全性也已经经过实验证实^[3]。从发状念珠藻中提取得到一种多糖Nostoflan，经实验证实对I型单纯疱疹病毒、流感病毒、人巨细胞病毒、SARS病毒等具封套病毒有明显的抗病毒活性，并可杀死离体培养的肿瘤细胞^[4]。

发状念珠藻生长极为缓慢，自然蕴藏量相当有限，而发状念珠藻价格的上涨使得对发状念珠藻的掠夺性采收加剧，发状念珠藻资源遭受严重破坏，以致濒临枯竭。深层培养是微生物发酵中的常规技术手段。发状念珠藻具有藻类和细菌的双重特性，液体深层培养可以作为发状念珠藻大规模培养的可能途径^[5]。蓝藻是原核的光合放氧微生物，细胞内没有独立的线粒体，其呼吸链和光合电子传递链共处于类囊体膜上，并共用质鲲和细胞色素b/f作为电子递体，因此蓝藻的光自养特性较强，对有机物的亲和力较弱^[6]。已有的研究结果表明仅有二十几种蓝藻能在黑暗中利用有机物生长^[7]。但是可以进行混合营养生长的蓝藻较多。本文对发状念珠藻细胞混合营养生长的可能性进行了研究，并对其混合营养和光合自养培养的生长特性、叶绿素浓度和发状念珠藻多糖产量进行了研究，为发状念珠藻细胞高密度培养提供基础数据，也为进一步大规模培养奠定基础。

1　材料和方法

1.1　实验材料

1.1.1　发状念珠藻细胞种

天津科技大学生化工程研究室提供

1.1.2　培养基

种子培养基： BG-11培养基^[8]。

混合营养培养基：添加适当浓度葡萄糖的BG-11培养基。

1.2　　方法

1.2.1　发状念珠藻单体细胞种子液的制备

将实验室保藏发状念珠藻细胞种在BG-11培养基上划线分离纯化，挑取固体培养基上的单藻落置于BG-11液体培养基中扩大培养，取对数期发状念珠藻细胞培养液作为实验细胞种子液。

1.2.2　发状念珠藻细胞的培养

光合自养培养：在500ml的摇瓶中装有140ml培养基，灭菌冷却后，按10% （v/v）接种量接入发状念珠藻细胞种子培养液后置于光照振荡器内培养，培养温度25℃，转速140rpm，三角瓶表面平均光照强度60 umol.m^-2s^-1，连续光照。每组试验设置三个平行。混合营养培养：混合营养培养的培养基的葡萄糖初始浓度为3.95 gL^-1。其他培养条件同光合自养培养。

1.3　分析方法

1.3.1　生物量的测定

比浊法：发状念珠藻细胞的密度用细胞培养液在750nm处的光密度（OD）值来表示。用752紫外光栅分光光度计每天测定发状念珠藻细胞培养液的光密度值。当细胞液的OD值大于0.6时，需将细胞液稀释后再进行测定。

干重法：取100ml细胞培养液，离心3000 rpm，30min；弃上清液，加入等体积去离子水，混匀，再离心，用去离子水洗涤三次，最后弃掉上清液，收集细胞于80℃干燥至恒重。

1.3.2　葡萄糖浓度测定

取10ml发状念珠藻细胞培养液，经4000rpm，20min离心后取上清液，用SBA生物传感分析仪测定。

1.3.3　光照强度测定

用QuantithermQRT1光度计（Hansatech Corporation英国）测定培养瓶液体表面4个点的光照强度，计算其平均值，

1.3.4　叶绿素a测定^[9]

取V样（ml）样品于4000rpm离心10min，弃上清，藻体重新悬浮于V甲醇（ml）中，盖严离心管，于4℃冰箱黑暗条件下储藏过夜，再于4000rpm离心，取上清液于665nm下，以甲醇为参比液测定吸光值A_665，藻液中的叶绿素含量按下式计算（Hall&Rao，1994）

Chla （ug/ml） =13.9×A₆₆₅×V甲醇／V样

1.3.5　发状念珠藻胞外多糖的测定

苯酚-硫酸法^[10]。

2　结果与讨论

2.1　发状念珠藻细胞光合自养生长

当光照强度为60 umol.m^-2s^-1，摇瓶发状念珠藻细胞的光合自养分批培养的生长曲线如图1。

图1　发状念珠藻细胞光合自养生长曲线

从图1可以看出，发状念珠藻细胞接种后没有出现明显的延迟期，细胞基本呈线性生长，培养19d后细胞生长进入稳定期。对于光合自养生长的线性阶段，发状念珠藻细胞的浓度与时间成线性关系，因此其生长过程近似为一级反应，藻细胞的密度Xa随时间的变化可以表示为：

对试验数据用最小二乘法回归可得a＝0.02； a₀＝0.0564，所以（1）式可以写为：Xa＝0.02t＋0.0564。相关系数R²＝0.9937，利用回归表达式计算的结果与实测值的平均值相对偏差为0.31%。

2.2　发状念珠藻细胞混合营养生长

图2表示了初始葡萄糖浓度3.95gL^-1，入射光强为60 umol.m^-2s^-1时发状念珠藻细胞混合营养分批培养过程藻细胞浓度和残余葡萄糖浓度的变化。

图2　发状念珠藻细胞混合营养生长曲线

由图可见，发状念珠藻细胞可以利用葡萄糖进行混合营养生长。其混合营养的生长曲线为一条曲线，生长过程受底物浓度的影响，因此生长过程可以近似为一个二级反应，细胞浓度与培养时间的关系可以表达成如下关系：

由实验数据用最小二乘法回归得a₀＝0.0579，a₁＝0.2198，a₂＝-0.0038，所以（2）式可以写为： Xm＝0.0579+0.2198t-0.0038t²。相关系数R²＝0.9869，计算值与实测值的平均相对偏差为4.03%。

由图1和图2比较可以看出，在相同的光照强度下，混合营养生长的发状念珠藻细胞密度比同期光自养培养的细胞密度要高。培养8d收获混合营养发状念珠藻细胞生物量为2.27gL^-1，是同期光合自养培养的3.98倍。

2.3　混合营养和光合自养培养发状念珠藻细胞的叶绿素a浓度

图3　发状念珠藻细胞混合营养和光合自养分批培养过程中的叶绿素浓度

图3比较了光合自养和混合营养分批培养过程中叶绿素a的浓度，培养摇瓶表面的平均光强为60 umol.m^-2s^-1，混合营养的初始葡萄糖浓度为3.95 gL^-1。从图中数据可以看出，混合营养培养的叶绿素a的浓度明显比同期光合自养要高，混合营养培养8d时叶绿素a浓度为5.57mgL^-1，是同期光合自养培养的2.32倍。

2.4　混合营养和光合自养培养发状念珠藻多糖含量的比较

图4　混合营养和光合自养分批培养发状念珠藻多糖产量的比较

混合营养培养发状念珠藻细胞培养液胞外多糖的含量得到较大的提高，培养8d多糖产量达到239.93m gL^-1，是同期光合自养培养的5.9倍，是光合自养培养20d多糖产量的2.24倍。由此可见在培养基中添加有机碳源葡萄糖既可以提高发状念珠藻细胞的生长速率，又可以提高发状念珠藻多糖的产量。

3　结论

发状念珠藻可以利用有机碳源（葡萄糖）进行混合营养生长。摇瓶培养发状念珠藻细胞混合营养培养系统明显优于光合自养培养系统。当摇瓶表面入射光强为60 umol.m^-2s^-1，初始葡萄糖浓度为3.95 gL^-1的混合营养培养，培养8d发状念珠藻细胞进入生长稳定期，收获发状念珠藻细胞干重为2.27 gL^-1，叶绿素浓度为5.57mgL^-1，发状念珠藻多糖产量为239.93mgL^-1，分别是同期光合自养培养的3.98倍、2.32倍和5.9倍。

混合营养培养体系与光合自养培养体系相比可以获得较高的发状念珠藻细胞生物量，高的细胞浓度在生产中具有更大的优势。

参考文献：

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【注释】

(1)基金项目:国家自然科学基金（20376061）和天津市科技发展计划重点基金（043801611）