细菌-乳酸发酵方式及培养基的优化

细菌L-乳酸发酵方式及培养基的优化

晋明芬　高年发

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：利用细菌进行L-乳酸的发酵，该细菌为兼性厌氧菌，通过几种发酵方式的比较，得出适合该菌种的发酵方式为先摇床振荡培养24h后再转入静置培养；同时对玉米糖化液的初糖浓度进行比较，确定初糖浓度应控制在120～140 g/L；利用响应面法，通过中心组合实验及响应面分析优化了发酵培养基中的3个因素，即蛋白胨、豆粕水解液和玉米浆的量，建立了影响因素与响应值L-乳酸产量之间的函数关系，得到一个回归方程，根据回归方程寻优得出，豆粕水解液为34.07 g/L，蛋白胨为24.40g/L，玉米浆为10 g/L。在此培养方式及培养基的基础上进行摇瓶发酵，乳酸产量为117.03g/L，转化率为97.53%，纯度为97.94047%，而且转化率比优化前的78.95%提高了18.58%。

关键词：细菌TL-2； L-乳酸；发酵方式；响应面分析法

乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸，广泛存在于人体、动物体、植物和微生物中，乳酸按其旋光性可分为D （-） -乳酸，L （+） -乳酸和DL-乳酸三种^[1]。人体只能代谢利用其中的L-乳酸，因此，世界卫生组织提倡使用L-乳酸作为食品添加剂和内服药，取代目前普遍使用的DL-乳酸。此外，L-乳酸、L-乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、农业和化学工业。尤其近几年，人们利用L-乳酸聚合生成的聚L-乳酸（PLA）制造生物降解塑料、绿色包装材料及家用薄膜，用以解决日益严重的环境污染问题，引起了世界的广泛关注，应用前景非常广阔^[2]。乳酸的发展潜力巨大，被称为化工产品中沉睡的巨人^[3]。

提高L-乳酸产量、纯度及转化率，降低生产成本，是乳酸迅速发展的基本前提。而要提高产量，降低成本，就需要对生产菌种的发酵培养方式及发酵培养基进行优化，为后续的工业化生产提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1　菌种

细菌TL-2（Lactobacillus casei，乳酸乳杆菌干酪亚种） ，由本研究室保藏。

1.2　培养基（g/L）

种子培养基葡萄糖40 （玉米糖化液） ，小肽（由黑龙江乐能生物公司提供） 30，玉米浆5，豆粕水解液10，KH₂PO₄1，（NH₄）₂SO₄5，碳酸钙50，pH 6.0～6.5。灭菌条件： 115℃，15min。

发酵培养基葡萄糖120～140 （玉米糖化液） ，豆粕水解液30，蛋白胨20，玉米浆10，碳酸钙量为糖量的45%，pH 6.0～6.5。灭菌条件： 115℃，15min。

1.3　分析方法

乳酸和葡萄糖的测定：采用生物传感分析仪（SBA-40C ，山东省科学院生物研究所研制）测量。

菌体浓度的测定：比浊法（A600） 。

L-乳酸的纯度的测定：高效液相色谱法测定发酵液中的乳酸总量，用SBA-40C生物传感分析仪测L-乳酸含量，两者之比即得发酵液中L-乳酸的纯度。

2　结果与讨论

2.1　静置发酵和摇床发酵的比较

从图1可以看出，同样培养基，同样接种量的条件下，摇床发酵比静置发酵产酸快，产量高且残糖少，发酵周期短。这说明在发酵时增加一定的溶氧能够促进乳酸菌TL-2的生长并使之多产乳酸。

图1　摇床和静置发酵时产酸和耗糖曲线

图2　不同摇床培养时间乳酸发酵的比较

兼性厌氧发酵要经过有氧呼吸和厌氧发酵这两个代谢过程，因而它介于这两者之间^[8]。根据同型乳酸发酵机理，乳酸菌在在厌氧条件下利用葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下接受氢被还原成乳酸。EMP途径必须是厌氧条件，但是丙酮酸存在时，即使有氧存在，大量乳酸也可积累^[7]。

2.2　摇床培养时间对于乳酸发酵的影响^[4]

从图2可以看出，摇床培养24h、28h、32h、36h后再静置培养，葡萄糖都可以消耗完全，而且产酸与转化率都差不多，从工业角度，应选用摇床培养24h后再转为静置培养，可减少动力消耗，节省成本，提高乳酸产量。

2.3　先摇床再静置培养乳酸发酵过程中的降糖、产酸及菌体生长曲线

图3为摇床培养24h后再转入静置培养的乳酸整个发酵过程中的糖、酸及菌体生长变化的趋势图。从图中可以看出菌体16h后进入稳定期，葡萄糖含量16h后也迅速下降，进入快速产酸阶段。本条件基本符合乳酸菌的发酵机理，能够实现高产酸，并实现较高的转化率，相对的缩短了发酵周期，减少了能量损耗，降低了生产成本。

2.4　初糖浓度对于乳酸发酵的影响^[9，10]

从图4可以看出，随着初糖浓度的增加，乳酸产量提高了，但是转化率却并非如此，所以发酵时，初糖浓度应控制在120～140 g/L。

图3　乳酸发酵降糖、产酸及菌体生长曲线

图4　不同初糖浓度乳酸发酵的比较

2.5　响应面分析法优化发酵培养基^[4，5，6]

在上述条件下，利用SAS8.01软件对发酵培养基中的三种成分进行优化。通过二次回归的旋转中心结合设计^[11，12]，对这3个因素进行寻优，以乳酸的产量为响应值，对应于因变量Y。各自变量水平见表1，实验设计及结果见表2。

表1　发酵培养基因素水平编码

表2　实验方案与结果

X₁= （x₁-20） ／10； X₂= （x₂-10） ／5； X₃= （x₃-30） ／10；

通过SAS 8.01软件对表2实验数据进行二次多项回归拟合，获得乳酸浓度对蛋白胨、玉米浆和豆粕水解液的二次多项式回归方程为：

Y=115.8414+0.24131X₁+0.85704X₂+2.93724X₃-2.55687X₁²-1.5625X₁X₂-0.3125X₁X₃

-2.55687X₂²-0.315X₂X₃-3.44076X₃²

式中Y为乳酸浓度的预测值，X₁、X₂、X₃分别为蛋白胨、玉米浆和豆粕水解液的编码值。该二次回归方程的方差分析结果见表3。

表3　二次回归方程的方差分析表

由该方程的方差分析可见，该模型极显著（F=13.8803 > F_0.01（9，10） =4.94） ，而且经分析计算，该模型的确定系数R²=92.59% ，表明模型与实际情况拟合很好，能解释92.59%乳酸浓度的变化，因此该模型可用于分析和预测发酵过程中乳酸的产量。

图5至图7为响应面分析的立体图，从图中可直观地看出，各因子对响应值的影响变化趋势。而且回归模型确实存在最大值，求解方程3组成的方程组，可得模型极值点坐标（X_1，X_2，X₃）的代码值为（0.4402 ，0.0020 ，0.4068） ，对应的实际值为：蛋白胨（X₁） =24.40；玉米浆（X₂） = 10.00；豆粕水解液（X₃） = 34.07。此时，模型预测的最大估计值为116.98g/L。为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵条件进行发酵实验，所得实际乳酸产量为117.03g/L，可见该模型能较好地预测实际发酵情况。

图5　响应面

图6　响应面

图7　响应面

3　结论

通过对乳酸发酵培养方式及培养基优化得出：先摇床培养24h后转入静置培养，初糖浓度为120～140 g/L时适合TL-2菌的发酵。并在初糖浓度为120g/L时，响应面分析法得到最优的发酵培养基为：豆粕水解液为34.07 g/L，蛋白胨为24.40g/L，玉米浆为10 g/L。在此培养方式及培养基的基础上进行摇瓶发酵，乳酸产量为117.03g/L，转化率为97.53%，液相测得纯度为97.94047%，，而且转化率比优化前的78.95%提高了18.58%。

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