细菌的培养

第二节　细菌的培养

一、病料的处理

采集的病料，在接种培养前，应对其性状进行观察并作记录，如：是否脓性带血或腐败，有何异味。各种病料在分离培养前均应涂片，作革兰氏染色、镜检，以了解细菌的形态、染色特性，并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果，对病料中可能含有的病原菌作最初步的估价。

如果病料是病变组织，又是用无菌方法采集的，在接种前一般无需作特别处理。但如果病料被杂菌污染严重，则需根据要分离的病原菌的特性，采用一些对病原菌无害但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法，以抑制杂菌生长。例如从粪便中分离沙门氏杆菌，可将粪样接种于亚硒酸钠肉汤中，作增菌处理。在这种培养基中，其他杂菌被抑制，而沙门氏杆菌则能自由繁殖。又如，分离布鲁氏杆菌、胎儿弯曲杆菌、炭疽杆菌、副结核杆菌可用选择性抗菌琼脂。分离链球菌和猪丹毒杆菌用叠氮钠结晶紫血琼脂等。如果从肠道内容物或从污染有不产生芽孢的杂菌培养物中分离能形成芽孢的细菌（如魏氏梭菌、破伤风梭菌等），可将病料在80℃加热15min，以杀死不形成芽孢的杂菌，再接种培养基，即容易获得纯培养物。

有些病料（如奶、尿等）含菌太少，则应先作集菌处理，然后接种，以提高检出率，其集菌方法有离心法和过滤法。离心法取沉淀物作培养物；过滤后取沉积于滤板上表面的病料作培养。还有些细菌往往在细胞浆内集结成团，在它们所形成的病灶中含菌较少，遇到这种情况，可将病料组织磨碎，制成乳剂，加入酶、酸或碱，消化组织，使菌团散开，然后离心，收集沉淀物作培养（如从肠黏膜分离副结核杆菌即用此法）。

二、细菌的分离与接种

培养细菌时，须将标本或细菌培养物接种于培养基上，常用接种方法有如下几种。

1.平板划线接种法　本法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌，分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30min，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。常用的平板划线接种法有以下几种：

（1）分区划线法　此法多用于脓汁、粪便等含菌量较多的标本的分离。其方法是首先将接种环灭菌后，蘸取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分（第一区），将接种环火焰灭菌，待冷却后只通过第一区3～4次后连续划线（为第二区），依次可共划线3～5区，每一区细菌数可逐渐减少，直到分离出单个菌落为止。

（2）连续划线法　该法多用于含菌数量较少的标本。其方法是首先用接种环将标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分，然后由此开始，在培养基表面自左向右连续划线并逐渐向下移动，直到下边缘。划线接种时，尽可能做到直、密、匀，有效地利用培养基表面达到充分分离的目的。如果标本含菌较多，接种在强选择培养基（如SS琼脂）上时或标本含菌较少时，采用分区划线法接种，接种环可一直划完各区，中间不必灭菌。

2.斜面接种法　采用该法目的是进行纯培养。其方法是从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上划一条直线，再从底部开始向上划曲线接种，尽可能密而匀，或者直接自下而上划曲线接种。

3.倾注培养法　此法适用于乳汁和尿液等液体标本的细菌计数。其方法是取原标本或经适当稀释（一般是10^－1～10^－5倍稀释）的标本1ml，置于直径9cm无菌平皿内，倾入已溶化并冷至50℃左右的培养基约15ml，立即混匀待凝固后倒置于37℃培养18～24h，做菌落计数。

4.穿刺接种法　本法多用于双糖、明胶等多层培养基的接种。方法是用接种针挑取菌落或培养物，由培养基中央直刺到距管底0.3～0.5cm处。然后沿穿刺线退出接种针，若为双糖等含高层斜面的培养基则光穿刺高层部分，退出接种针后直接曲线接种斜面部分。

5.液体接种法　本法多用于普通肉汤、蛋白胨水等液体培养基的接种。其方法是接种环蘸取菌种，倾斜液体培养基管，先在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体能淹没接种物为准），然后再在液体中摆动2～3次接种环，塞好棉塞后轻轻混合即可。

三、细菌的培养方法

根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法3种。

（一）一般培养法

将已接种过的培养基，置37℃培养箱内18～24h，需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3～7d直至一个月才能生长。为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石蜡凡士林封固，以防培养基干裂。

（二）二氧化碳培养

某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法，常用方法有以下几种。

1.二氧化碳培养箱　可将已接种的培养基直接放入箱内孵育，即可获得二氧化碳环境。

2.烛缸法　将已接种的培养基，置于容量为2000ml的磨口标本缸或干燥器内。缸盖或缸口处均需涂以凡士林，然后点燃蜡烛直立置入缸中，密封缸盖。待自行熄灭时，容器内约含5%～10%的CO₂容器置37℃培养。

3.重碳酸钠—盐酸法　每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例，分别将两种药各置一器皿内（如平皿内），连同器皿置于标本缸或干燥器内，盖严后使容器倾斜，两种药品接触后即可产生二氧化碳CO₂。

（三）厌氧培养法

目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱3种。

1.厌氧罐法　厌氧罐法是目前应用较广泛的一种方法，共分为以下几种。

（1）抽气－换气法：该法适用于一般实验室，其特点是经济并可迅速建立厌氧环境。标本接种后，将平板放入厌氧罐，拧紧盖子，用真空泵抽出罐中空气，使压力真空表至79.98kPa，停止抽气，充入高纯氮气使压力真空表指针回0位，连续反复3次，最后在罐内79.98kPa的情况下，充入70%的N₂、20% H₂、10% CO₂（有人改用20% CO₂及80% H₂，亦可获得好结果）。罐中需放入冷催化剂钯粒，可催化罐中残余的O₂和H₂化合成水。同时罐中应放有美蓝指示管，美蓝在有氧的环境下呈蓝色，无氧时为红色。临用前首先将美蓝煮沸变成无色，放入罐中先呈浅蓝色，待罐中无氧环境形成，美蓝即可持续无色。

（2）气体发生袋　气体发生袋系由锡箔密封包装，其中含有两种药片，一种为含枸橼酸和重碳酸氢钠的药片，另一种是含有硼氢化钠的药片。前者遇水放出二氧化碳，后者可释放氢。使用时在袋的右上角剪一小口，灌进10ml蒸馏水，立即放入含有钯粒、指示剂及平板培养基的厌氧罐中，拧紧盖子经2～3min后，可感到盖子微热并有少量水蒸气出现。封口后1h左右罐中O₂的含量可低于＜1%。

2.气袋法　此种方法不需要特殊设备，操作简单，使用方便，不但实验室中可用，而且外出采样、现场接种也可用。原理与气体发生袋完全相同，只是采用塑料袋代替了厌氧罐，气袋为一透明而密闭的塑料袋，内装有气体发生安瓿、指示剂安瓿、含有催化剂的带孔塑料管各一支。其操作方法为首先将接种的平板培养基放入袋中，用弹簧夹夹紧袋口，然后用手指压碎气体安瓿，20min后再压碎指示剂安瓿，如果指示剂不变蓝色，说明袋内达到厌氧状态，即可放入37℃进行培养。

3.厌氧培养箱法　使用之前须仔细检查厌氧装备有无漏气等问题，以及催化剂、指示剂质量等。使用时严格遵守操作规程，保证箱内气体比例合理。