微生物的主要产能代谢途径与能量转换方式

微生物的主要产能代谢途径与能量转换方式_微生物学

微生物产能代谢可分为发酵、呼吸（含有氧呼吸与无氧呼吸）两类代谢途径，以及底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化三种化能与光能转换为生物通用能源的能量转换方式。

（一）发酵与底物水平磷酸化

发酵（fermentation）有广义与狭义两种概念。广义的发酵是指微生物在有氧或无氧条件下利用营养物生长繁殖并生产人类有用产品的过程。例如在发酵工业上用苏云金芽孢杆菌等生产生物杀虫剂，利用酵母菌生产面包酵母或酒精，利用链霉菌生产抗生素等通称为发酵。而狭义的发酵仅仅是指微生物生理学意义上的，它一般是指微生物在无氧条件下利用底物代谢时，将有机物生物氧化过程中释放的电子直接转移给底物本身未彻底氧化的中间产物，生成代谢产物并释放能量的过程。这里讨论的是狭义的发酵。

微生物进行能量代谢的途径具有丰富的多样性。微生物中已揭示的利用底物（葡萄糖等）发酵产能代谢的主要有EMP、HMP、ED、WD（含PK和HK两条途径）和Stickland等六条途径。这些途径中释放的可被利用的能量，部分是通过底物水平磷酸化生成ATP等，部分被转移至递能分子中形成还原力［H］。

1.主要发酵产能代谢途径

（1）EMP途径及其终产物和发酵产能

EMP途径（Embden-Meyerhof pathway）以葡萄糖为起始底物，丙酮酸为其终产物，整个代谢途径历经10步反应，分为两个阶段：

EMP途径的第一阶段为耗能阶段。在这一阶段中，不仅没有能量释放，还在以下两步反应中消耗2分子ATP：①在葡萄糖被细胞吸收运输进入胞内的过程中，葡萄糖被磷酸化，消耗了1分子ATP，形成6-磷酸葡萄糖；②6-磷酸葡萄糖进一步转化为6-磷酸果糖后，再一次被磷酸化，形成1，6-二磷酸果糖，此步反应又消耗了1分子ATP。而后，在醛缩酶催化下，1，6-二磷酸果糖裂解形成2个三碳中间产物———3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮。在细胞中，磷酸二羟丙酮为不稳定的中间代谢产物，通常很快转变为3-磷酸甘油醛而进入下步反应。

因此，在第一阶段实际是消耗了2分子ATP，生成2分子3-磷酸甘油醛；这一阶段为第二阶段的进一步反应做准备，故一般称为准备阶段。

EMP途径的第二阶段为产能阶段。在这第二阶段中，3-磷酸甘油醛接受无机磷酸被进一步磷酸化，此步以NAD＋为受氢体发生氧化还原反应，3-磷酸甘油醛转化为1，3-二磷酸甘油酸；同时，NAD＋接受氢（2e＋2H＋）被还原生成NADH2。与磷酸己糖中的有机磷酸键不同，二磷酸甘油酸中的2个磷酸键为高能磷酸键。在1，3-二磷酸甘油酸转变成3-磷酸甘油酸及随后发生的磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸的2个反应中，发生能量释放与转化，各生成1分子ATP。EMP途径的各个反应步骤见图4-5。

综上所述，EMP途径以1分子葡萄糖为起始底物，历经10步反应，产生4分子ATP。由于在反应的第一阶段消耗2分子ATP，故净得2分子ATP；同时生成2分子NADH2和2分子丙酮酸。

EMP途径是微生物基础代谢的重要途径之一。必须指出，从现象看，似乎只要有源源不断的葡萄糖提供给细胞，它就可产生大量的ATP、丙酮酸、NADH2。其实不然，因为只要是氧化还原反应，其氧化反应与还原反应两者是相偶联与平衡的。在细胞内，EMP途径的第二阶段开始有底物释放电子的氧化反应发生，消耗2分子氧化态的NAD＋，产生2分子还原态的NADH2。但若要保持EMP途径持续运行，必须有底物吸纳电子与氢而还原，并使NADH2氧化再生成氧化态NAD＋，以有足够的氧化型NAD＋作为受氢体再循环参与3-磷酸甘油醛转化为1，3-二磷酸油甘酸的脱氢氧化反应，从而保持氧化还原反应的持续平衡进行，同时不断生成ATP，以供细胞生命活动中能量之所需。因此，在保证葡萄糖供给的条件下，胞内NADH2氧化脱氢（2e－＋2H＋）后，受氢体的来源与数量成为EMP途径能否持续运行的决定性条件，否则，EMP途径的运行将受阻。

图4-5 EMP途径及某些微生物以丙酮酸为底物的发酵产能

G：葡萄糖；G6P：葡萄糖-6-磷酸；F6P：果糖-6-磷酸；F1，6P：果糖-1，6-二磷酸；DHAP：二羟丙酮磷酸；GA3P：甘油醛-3-磷酸；G1，3P：1，3-二磷酸甘油酸；G3P：3-磷酸甘油酸；G2P：2-磷酸甘油酸；EPP：磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr：丙酮酸

在微生物中，使EMP途径顺畅运行的受氢体主要有两类：

一是在有氧条件下，以氧作为受氢体。NADH2途经呼吸链脱氢氧化，最终生成H2O和氧化态NAD＋，而在NADH2途经呼吸链过程中生成ATP（将在“呼吸作用”一节中详述）。

二是在无氧条件下发酵时，以胞内中间代谢物为受氢体。还原态的NADH2被氧化，生成氧化态NAD＋和分解不彻底的还原态中间代谢产物。如在无氧条件下的乳酸细菌中，丙酮酸作为受氢体被还原成乳酸（见图4-5第11步反应）。又如在酵母细胞中，丙酮酸经脱羧生成乙醛与CO2后，在NADH2参与下，乙醛作为受氢体被还原生成乙醇和氧化态NAD＋（见图4-5第12、13步反应）。在一些肠细菌中还生成多种副产物（见图4-5第14、15步反应）。也可由NADH2直接形成H2和NAD＋，反应式如下：

NADH＋H＋→NAD＋＋H2↑ ΔG0＝＋18.0k J／反应。

但这一反应必须在NAD＋被不断地应用掉或H2不断地离开生成处才能持续进行。

由上可知，微生物在无氧条件下的能量代谢，ATP的生成以EMP途径的第二阶段为主，但极为重要的是图4-5中的第三阶段，即丙酮酸后的发酵。没有丙酮酸后的发酵，细胞在无氧条件下的代谢受阻，难于持续获得生长与代谢需要的能量。

绝大多数微生物有EMP途径，包括大部分厌氧细菌如梭菌（Clostridium）、螺旋菌（Spirillum）等，兼性好氧细菌如大肠杆菌（E.coli），以及专性好氧细菌等。

EMP途径及随后的发酵，能为微生物的代谢活动提供ATP和NADH2外，其中间产物又可为微生物细胞的一系列合成代谢提供碳骨架，并在一定条件下可逆转合成多糖。

（2）HMP途径

HMP途径（hexose monophosphate pathway）是从6-磷酸葡萄糖为起始底物，即在单磷酸己糖基础上开始降解，故称为单磷酸己糖途径，简称为HMP途径。HMP途径与EMP途径密切相关，因为HMP途径中的3-磷酸甘油醛可以进入EMP，因此该途径又可称为磷酸戊糖支路。HMP途径的反应过程见图4-6。

图4-6 HMP途径

（1）己糖激酶；（2）6-磷酸葡萄糖脱氢酶；（3）内酯酶；（4）6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；（5）5-磷酸核糖异构酶；（6）5-磷酸核酮糖差向异构酶；（7）转酮酶；（8）转醛酶；（9）同（7）；（10）磷酸丙糖差向异构酶；（11）醛缩酶；（12）磷酸果糖激酶；（13）磷酸葡萄糖异构酶

HMP途径也可分为两个阶段。

第一阶段即氧化阶段：从6-磷酸葡萄糖开始，经过脱氢、水解、氧化脱羧生成5-磷酸核酮糖和二氧化碳。即图4-6中（1）～（4）的阶段。

第二阶段即非氧化阶段：为磷酸戊糖之间的基团转移，缩合（分子重排）使6-磷酸己糖再生。即图4-6中（5）～（13）的阶段。

HMP途径的特点是：

① HMP途径是从6-磷酸葡萄糖酸脱羧开始降解的，这与EMP途径不同，EMP途径是在二磷酸己糖基础上开始降解的。

② HMP途径中的特征酶是转酮酶和转醛酶。

转酮酶催化下面二步反应：

5-磷酸木酮糖＋5-磷酸核糖→3-磷酸甘油＋7-磷酸景天庚酮糖

5-磷酸木酮糖＋4-磷酸赤藓糖→3-磷酸甘油醛＋6-磷酸果糖

转醛酶催化下面一步反应：

7-磷酸景天庚酮糖＋3-磷酸甘油醛→4-磷酸赤藓糖＋6-磷酸果糖

③ HMP途径一般只产生NADPH2，不产生NADH2。

④ HMP途径中的酶系定位于细胞质中。

HMP途径的生理功能主要有：

① 为生物合成提供多种碳骨架。5-磷酸核糖可以合成嘌呤、嘧啶核苷酸，进一步合成核酸，5-磷酸核糖也是合成辅酶［NAD（P），FAD（FMN）和CoA］的原料，4-磷酸赤藓糖是合成芳香族氨基酸的前体。

② HMP途径中的5-磷酸核酮糖可以转化为1，5-二磷酸核酮糖，在羧化酶催化下固定二氧化碳，这对于光能自养菌和化能自养菌具有重要意义。

③ 为生物合成提供还原力（NADPH）。

大多数好氧和兼性厌氧微生物中都具有HMP途径，而且在同一种微生物中，EMP和HMP途径常同时存在，单独具有EMP或HMP途径的微生物较少见。EMP和HMP途径的一些中间产物也能交叉转化和利用，以满足微生物代谢的多种需要。

微生物代谢中高能磷酸化合物如ATP等的生成是能量代谢的重要反应，而并非能量代谢的全部。HMP途径在糖被氧化降解的反应中，部分能量转移，形成大量的NADPH2，为生物合成提供还原力，同时输送中间代谢产物。虽然6个6-磷酸葡萄糖分子经HMP途径，再生5个6-磷酸葡萄糖分子，产生6分子CO2和Pi，并产生12个NADPH2，这12个NADPH2如经呼吸链氧化产能，最终可得到36个ATP。但是HMP途径的主要功能是为生物合成提供还原力和中间代谢产物，同时与EMP一起，构成细胞糖分解代谢与有关合成代谢的调控网络。

（3）ED途径

ED途径（Entner-Doudoroff pathway）是恩纳（Entner）和道特洛夫（Doudoroff，1952年）在研究嗜糖假单胞菌（Pseudomonas saccharophila）时发现的。

在这一途径中，6-磷酸葡萄糖先脱氢产生6-磷酸葡萄糖酸，后在脱水酶和醛缩酶的作用下，生成1分子3-磷酸甘油醛和1分子丙酮酸。3-磷酸甘油醛随后进入EMP途径转变成丙酮酸。1分子葡萄糖经ED途径最后产生2分子丙酮酸，以及净得各1分子的ATP、NADPH2和NADH2。ED途径见图4-7。

ED途径的特点是：

① 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛是有别于其他途径的特征性反应。

② 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶是ED途径特有的酶。

图4-7 ED途径及其与EMP、HMP、TCA关系

G：葡萄糖 G6P：6-磷酸葡萄糖 F6P：6-磷酸果糖 KDPG：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸 GAP：3-磷酸甘油醛 Pyr：丙酮酸 6PG：6-磷酸葡糖酸

③ ED途径中最终产物，即2分子丙酮酸，其来历不同。1分子是由2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸直接裂解产生，另1分子是由磷酸甘油醛经EMP途径获得。这2个丙酮酸的羧基分别来自葡萄糖分子的第1与第4位碳原子。

④ 1mol葡萄糖经ED途径只产生1mol ATP，从产能效率言，ED途径不如EMP途径。

表4-6为EMP、HMP、ED途径的特点比较。

表4-6 EMP、HMP、ED途径特点比较

在革兰氏阴性的假单胞菌属的一些细菌中，ED途径分布较广，如嗜糖假单胞菌（Pseudo-monas saccharophila）、铜绿假单细胞（Ps.aeruginosa）、荧光假单胞菌（Ps.fluorescens）、林氏假单胞菌（Ps.lindneri）等。固氮菌的某些菌株中也存在ED途径。

表4-7表明了EMP、HMP和ED途径在某些微生物中存在的百分比。由表可见，HMP途径一般是与EMP途径并存，但ED途径可不依赖于EMP和HMP途径而独立存在。

表4-7 EMP、HMP、ED等糖代谢途径在微生物中的分布

（4）WD途径（含PK和HK两条途径）

WD途径是由沃勃（Warburg）、狄更斯（Dickens）、霍克（Horecker）等人发现的，故称WD途径。由于WD途径中的特征性酶是磷酸解酮酶（phosphoketolase），所以又称磷酸解酮酶途径。根据磷酸解酮酶的不同，把具有磷酸戊糖解酮酶的叫PK途径，把具有磷酸己糖解酮酶的叫HK途径。

肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），就是经PK途径利用葡萄糖进行异型乳酸发酵生成乳酸、乙醇和CO2（图4-8）。

图4-8 磷酸戊糖解酮酶（PK）途径

而两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）则是利用磷酸己糖解酮酶途径分解葡萄糖产生乙酸和乳酸的（见图4-9）。

（5）Stickland反应

上述4条途径均是以糖类为起始底物的代谢途径。而早在1934年，L.H.Stickland发现，某些厌氧梭菌如生孢梭菌（Clostridium sporogenes）等，可把一些氨基酸当做碳源、氮源和能源。这是以一种氨基酸作氢供体，另一种氨基酸作为氢受体进行生物氧化并获得能量的发酵产能方式。后将这种独特的发酵类型称为Stickland反应。Stickland反应是经底物水平磷酸化生成ATP，其产能效率相对较低。在Stickland反应中，作为供氢体的有多种氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和色氨酸等，作为受氢体的主要有甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸和精氨酸等。Clostridium sporogenes中以丙氨酸为供氢体和以甘氨酸为受氢体的Stickland反应途径见图4-10。

图4-9 磷酸己糖解酮酶HK途径

2.发酵途径中的底物水平磷酸化

在发酵途径中，通过底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation，SLP）合成ATP，是营养物质中释放的化学能转换成细胞可利用的自由能的主要方式。底物水平磷酸化是指ATP的形成直接由一个代谢中间产物上的高能磷酸基团转移到ADP分子上的作用，见图4-11。

在上述发酵过程中，形成的富能中间产物如磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰CoA等酰基类物，通过底物水平磷酸化形成ATP。底物水平磷酸化既存在于发酵过程中，也存在于呼吸作用过程的某些步骤中。如在EMP途径中，1，3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸以及磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸的过程中，均通过底物水平磷酸化分别产生1分子ATP。在三羧酸循环中，琥珀酰辅酶A转变为琥珀酸时通过底物水平磷酸化生成1分子高能磷酸化合物GTP。

图4-10 Clostridium sporogenes中以丙氨酸为供氢体和以甘氨酸为受氢体的Stickland反应

图4-11 底物水平磷酸化生成ATP的反应

3.微生物发酵代谢的多样性

在无氧条件下发酵时，不同微生物在以糖类为底物的重要代谢途径中，其终端产物或中间产物进一步发酵产能代谢的途径呈现出丰富的多样性，即使同一微生物利用同一底物发酵时也可能形成不同的末端产物。

如酵母菌利用葡萄糖进行的发酵，可根据不同条件下代谢产物的不同分为三种类型：

Ⅰ型发酵：酵母菌将葡萄糖经EMP途径降解生成2分子终端产物丙酮酸，后丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛作为氢受体使NADH2氧化生成NAD＋，同时乙醛被还原生成乙醇，这种发酵类型称为酵母的Ⅰ型发酵。

在酒精工业上，就是利用酿酒酵母（S.cerevisiae）的Ⅰ型发酵，主要以淀粉等碳水化合物降解后的葡萄糖等可发酵性糖为底物生产酒精的。酿酒酵母细胞从细胞外每输入1分子葡萄糖，在无氧条件下，经EMP途径及随后的反应，最终生成2分子乙醇与2分子的CO2，并将乙醇与CO2从胞内排出至胞外发酵液中。在酿酒酵母细胞内，这一反应每运行一次生成4分子ATP，其中2分子在下一轮分别用于第一阶段的第一和第三步的耗能反应，其余2分子ATP用于细胞生命活动的其他能量需要。而NAD＋作为受氢体和氢载体，在3-磷酸甘油醛氧化生成1，3-二磷酸甘油酸和乙醛还原生成乙醇这两步反应之间往返循环，推动反应持续进行。同时还有大量的热能释放，使发酵液的温度上升。

Ⅱ型发酵：当环境中存在亚硫酸氢钠时，亚硫酸氢钠可与乙醛反应，生成难溶的磺化羟基乙醛，该化合物失去了作为受氢体使NADH2脱氢氧化的性能，而不能形成乙醇，转而使磷酸二羟丙酮替代乙醛作为受氢体，生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油进一步水解脱磷酸生成甘油。此称为酵母的Ⅱ型发酵。这是利用酵母菌工业化生产甘油的“经典”途径。但实际上，酵母所处环境中的高浓度亚硫酸氢钠可抑制酵母细胞的生长与代谢，致使甘油发酵效率低。在要求酵母生长代谢活力与甘油发酵效率两者兼顾时，应控制较低浓度的亚硫酸氢钠，这样就不使100％的乙醛与亚硫酸氢钠反应，生成磺化羟基乙醛，而尚有部分乙醛被还原生成乙醇。

Ⅲ型发酵：葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，后脱羧生成乙醛，如处于弱碱性环境条件下（pH7.6），乙醛因得不到足够的氢而积累，2个乙醛分子间发生歧化反应，1分子乙醛作为氧化剂被还原成乙醇，另1个则作为还原剂被氧化为乙酸。而磷酸二羟丙酮作为NADH2的氢受体，使NAD＋再生，同时生成甘油。故Ⅲ型发酵的产物为乙醇、乙酸和甘油。

Ⅱ型发酵与Ⅲ型发酵产能较少，一般在非生长情况下才能进行。

许多细菌能利用葡萄糖产生乳酸，这类细菌称为乳酸细菌。根据产物的不同，乳酸发酵也有两种类型，即发酵产物只有乳酸的同型乳酸发酵和发酵产物除乳酸外还有乙酸、乙醇和CO2等的异型乳酸发酵。

（二）呼吸产能代谢

在物质与能量代谢中底物降解释放出的高位能电子，通过呼吸链（也称电子传递链）最终传递给外源电子受体O2或氧化型化合物，从而生成H2O或还原型产物并释放能量的过程，称为呼吸或呼吸作用（respiration）。在呼吸过程中通过氧化磷酸化合成ATP。呼吸与氧化磷酸化是微生物特别是好氧性微生物产能代谢中形成ATP的主要途径。在呼吸作用中，NAD、NADP、FAD和FMN等电子载体是呼吸链电子传递的参与者。因此，它们在呼吸产能代谢中发挥着重要的作用。

呼吸又可根据在呼吸链末端接受电子的是氧还是氧以外的氧化型物质，分为有氧呼吸与无氧呼吸两种类型。以分子氧作为最终电子受体的称为有氧呼吸（aerobic respiration），而以氧以外的外源氧化型化合物作为最终电子受体的称为无氧呼吸（anaerobic respiration）。

呼吸作用与发酵作用的根本区别在于：呼吸作用中，电子载体不是将电子直接传递给被部分降解的中间产物，而是与呼吸链的电子传递系统相偶联，使电子沿呼吸链传递，并达到电子传递系统末端交给最终电子受体，在电子传递的过程中逐步释放出能量并合成ATP。微生物通过呼吸作用能分解的有机物种类繁多，包括碳水化合物、脂肪酸、氨基酸和许多醇类等。

1.呼吸链与氧化磷酸化

呼吸链与氧化磷酸化紧密偶联，在产能代谢中起着不可替代的重要作用。

（1）呼吸链及其组分与分布

电子从NADH或FADH2到分子氧的传递所经过的途径称为呼吸链（respiratory chain），也称电子传递链（electron transport chain）。呼吸链主要由蛋白质复合体组成，大致分为4个部分，分别称为NADH-Q还原酶（NADH-Qreductase）、琥珀酸-Q还原酶（succinate-Q reductase）、细胞色素还原酶（cytochrome reductase）和细胞色素氧化酶（cytochrome oxi-dase）。典型的呼吸链组分及其在链中的排列顺序、电子传递方向见下列流程图4-12。此外，还有一些非蛋白的电子载体，如脂溶性醌类等。

NAD（P）-FP（黄素蛋白）-Fe-S（铁硫蛋白）-CoQ（辅酶Q）-Cytb-Cytc-Cyta-Cyta3

图4-12 典型的呼吸链与ATP合成酶复合体

图4-12中复合体Ⅰ（complex Ⅰ）为NADH-Q还原酶，又称为NADH脱氢酶（NADHde-hydrogenase），简称为复合体Ⅰ ，是一个相对分子质量为88kDa的大蛋白质分子。FMN、CoQ、NAD均为NADH-Q还原酶的辅酶。NAD是不与内膜紧密结合而自由扩散的电子传递链组分。此酶的作用是先与NADH结合并将NADH上的两个高势能电子转移到FMN辅基上，使NADH氧化，并使FMN还原。

复合体Ⅱ（complex Ⅱ）是琥珀酸-Q还原酶，是位于线粒体内膜的酶蛋白。完整的酶还包括柠檬酸循环中使琥珀酸氧化为延胡索酸的琥珀酸脱氢酶。FADH2为该酶的辅基，在传递电子时，FADH2将电子传递给琥珀酸脱氢酶分子的铁-硫蛋白。电子经过铁-硫蛋白又传递给CoQ从而进入了电子传递链。

复合体Ⅲ（complex Ⅲ）为细胞色素还原酶，又称辅酶-Q细胞色素c还原酶（coenzyme Q-cytochrome reductase）、细胞色素bc1复合体（cytochrome bc1 complex）或简称bc1等。除了极少数的专性厌氧微生物（obligate anaerobes）外，细胞色素几乎存在于所有的生物体内。细胞色素还原酶通过接受和送走电子的方式传递高势能的电子。

复合体Ⅳ（complex Ⅳ）为细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶又称为细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase）。其功能是接受细胞色素c传过来的电子并最终交给氧，经过一系列反应生成H2O。

在真核微生物中，呼吸链的成分大多位于线粒体内膜上，在原核生物中位于细胞质膜上。

（2）电子传递与ATP合成部位

电子传递和形成ATP的偶联机制称为氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）或称电子转移磷酸化（electron transfer phosphorylation，ETP）。氧化磷酸化是电子在沿着电子传递链传递过程中所伴随的，将ADP磷酸化而形成ATP的过程。

以NADH为起端的电子传递链上，释放自由能的部位有3处：由复合体Ⅰ将NADH放出的电子经FMN传递给CoQ的过程是第1个ATP合成部位；第2个部位是复合体Ⅲ ，它将电子由CoQ传递给细胞色素c的过程中合成ATP；第3个ATP合成部位是复合体Ⅳ ，它将电子从细胞色素c传递给氧的过程中合成ATP。

从图4-12可见，FADH2氧化释放的电子未经FMN而直接交给CoQ，因为，琥珀酸-Q还原酶将电子从FADH2转移到CoQ上的标准氧还电势变化（电势差）所蕴含的自由能不足以合成一个ATP。故该电子依次继续向细胞色素系统传递至Cytc的过程中才合成1个ATP。因此，凡以FADH2所携带的高势能电子传经呼吸链仅生成2个ATP（见图4-12用虚线表示的电子传递路径）。而NADH所携带的高势能电子传经呼吸链生成3个ATP（见图4-12用实线表示的电子传递路径）。故NADH提供的电子，其P／O＝3，而FADH2提供的电子，其P／O＝2。

（3）ATP合成与ATP合成酶

ATP合成是一个复杂的过程。ATP的合成是由一个位于线粒体、细菌内膜上的ATP酶来完成的。这个复合体最初被称为线粒体ATP酶（mitochondrial ATPase）或称为H-ATP酶（H＋-ATPase），现被称为ATP合成酶（ATP synthase，ATPase）。ATP合成酶和电子传递酶类不同。电子传递所释放出的自由能必须通过ATP合成酶转换成可保存的ATP形式，这种能量的保存和ATP合成酶对它的转换过程称为能量偶联（energy coupling）或能量转换（energy conversion）。ATPase及其能量的转换见图4-13所示。

图4-13 ATPase结构（a）及其能量的转换（b）

（转引自沈萍主编《微生物学》，高等教育出版社，2000）

ATPase由位于膜内的F0部分和位于膜外的F1部分及其两者之间的连接部分（也称颈部）组成。膜外部分由3个α亚基和3个β亚基相隔依次围绕γ亚基排列组成，ATP合成的活性位点在β亚基上。β亚基有3个不同的构象，即空结合位点的构象、与ADP和Pi结合的构象和与ATP结合的构象。γ也是连接F1和F0的颈部的主要亚基，δ和ε亚基也参与了这一组成。F0是位于膜内的一个质子通道。当膜内外形成质子梯度后，质子通过F0质子通道进入F1并驱动α亚基和β亚基围绕γ亚基做旋转运动，γ亚基与3种构象不同的β亚基依次接触，β亚基的构象在与γ亚基的旋转接触过程中不断依次发生变化，即与底物ADP和Pi与空位点结合，催化合成并释放ATP，如此循环往复。

电子传递与氧化磷酸化作用相偶联是一个不争的事实，但其中的机理问题仍未完全阐明。对此曾有三种假说，即化学偶联假说（chemical coupling hypothesis）、结构偶联假说（confor-mational coupling hypothesis）和由Michaell提出的化学渗透假说（chemiosmotic hypothe-sis）。其中化学渗透假说已获得相对较多的实验证据支持并为较多学者所认同。

就目前所知，电子传递链上氧化磷酸化合成ATP的大致机制是：电子在呼吸链传递产生的自由能，使在特定部位的质子泵（proton pump）驱动H＋从基质跨过内膜到达膜间隙的一边，从而形成内膜两边电化学电势差，使基质的H＋浓度低于膜间隙，因而基质形成负电势，而膜间隙形成正电势。这样就形成了电化学梯度即电动势（electromotive force，EMF），此可称为质子动势或质子动力（proton motive force，PMF），将这种质子动势蕴含的自由能作为动力，驱动位于内膜中的ATP合成酶（复合体Ⅴ）将H＋从膜间隙一边经质子通道泵回至基质一边，在这一过程中将能量转移给ADP与Pi合成ATP。同时降低内膜两边的电化学电势差，并实现H＋的跨膜循环（见图4-12和4-13）。

（4）微生物中呼吸链的多样性

微生物作为生物三大类群之一，它是一个种类极其繁多的生物世界，某些种类的进化程度差异比较大。这种根本的差异在呼吸链组成与结构等方面有所显现。尤其是异养与自养这两大类微生物的呼吸链组成与结构在某些种属间有较明显的不同，如真核微生物酵母菌具有组成与结构完整的呼吸链（如图4-12所示），而一些营有氧或无氧呼吸获得能量的自养微生物中的某些代谢类型，其呼吸链较短，有的甚至只有1～2类氧化还原酶系组成，它们把简单的无机物作为电子供体，这些电子供体直接与位于细胞质膜中的呼吸链组分偶联传递电子，进行氧化磷酸化生成ATP。其呼吸链组分不全，长度较短，结果是氧化磷酸化生成ATP的偶联位少，因此，电子流经呼吸链时产能少，根本原因是它们所能利用的无机电子供体所载有的能量大多数较少，这是导致自养型微生物生长比较缓慢的重要原因，见图4-15。

2.有氧呼吸产能途径

有氧呼吸也称好氧呼吸，它是最为普遍的生物氧化产能方式。微生物能量代谢中的有氧呼吸可根据呼吸基质即能源物质的性质分为两种类型，一是主要以有机能源物质为呼吸基质的化能异养型微生物中存在的有氧呼吸，二是以无机能源物质为呼吸基质的化能自养型微生物的有氧呼吸。这两种类型的呼吸作用的共同特点是它们的最终电子受体均为氧。

（1）以有机物为呼吸基质的有氧呼吸

常见的异养微生物最易利用的能源和碳源有葡萄糖等。葡萄糖经EMP途径酵解形成的丙酮酸，在无氧的条件下经发酵转变成不同的发酵产物，如乳酸、乙醇和CO2等，并产生少量能量。但在环境有氧的条件下，细胞行有氧呼吸，丙酮酸先转变为乙酰CoA（acetyl-coenzyme A，acetyl-CoA），随即进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，简称TCA循环），被彻底氧化生成CO2和水，同时释放大量能量，见图4-14TCA循环图。

从TCA循环图与电子传递链产能反应（见图4-12和4-14）可见，1分子丙酮酸经TCA循环而被彻底氧化，共释放出3分子CO2，生成4分子的NADH2和1分子的FADH2，通过底物水平磷酸化产生1分子的GTP。而每分子NADH2经电子传递链，通过氧化磷酸化产生3分子ATP，每分子FADH2经电子传递链通过氧化磷酸化产生2分子ATP。因此，1分子的丙酮酸经有氧呼吸彻底氧化，生成ATP分子的数量为：4×3＋1×2＋1＝15。

微生物行有氧呼吸时，葡萄糖的利用首先经EMP途径生成2分子丙酮酸，并经底物水平磷酸化产生4分子ATP和2分子NADH2。在有氧条件下，EMP途径中生成2分子NADH2可进入电子传递链，经氧化磷酸化产生6分子ATP。因此，在有氧条件下，微生物经EMP途径与TCA循环，通过底物水平磷酸化与氧化磷酸化，彻底氧化分解1mol葡萄糖，共产生40mol ATP。但在EMP途径中，葡萄糖经2次磷酸化生成1，6-二磷酸果糖的过程中有2步为耗能反应，共消耗了2分子ATP，故净得38mol ATP。

图4-14 三羧酸（TCA）循环

已知ATP水解为ADP释放的能量约为31.8k J／mol，故1mol葡萄糖被彻底氧化时约有1208k J（31.8k J×38）的能量被转储于ATP的高能磷酸键中。1mol葡萄糖被彻底氧化为CO2和H2O可释放的总能量约为2822k J。因此好氧微生物通过有氧呼吸利用葡萄糖，其能量利用效率约为43％ ，其余的能量以热等形式散失。可见，生物机体在有氧条件下的能量利用效率极高。

（2）以无机物为呼吸基质的有氧呼吸

好氧或兼性的化能无机自养型微生物能从无机化合物的氧化中获得能量。它们能以无机物如NH4＋ 、NO－2、H2S、S0、H2和Fe2＋等为呼吸基质，把它们作为电子供体，氧为最终电子受体，电子供体被氧化后释放的电子，经过呼吸链和氧化磷酸化合成ATP，为还原同化CO2提供能量。因此，化能自养菌一般是好氧菌。这类好氧型的化能无机自养型微生物分别属于氢细菌、硫化细菌、硝化细菌和铁细菌等。它们广泛分布在土壤和水域中，并对自然界的物质转化起着重要的作用。这些微生物的产能途径见下列化学反应式：

化能自养微生物对底物的要求具有严格的专一性，即用作能源的无机物及其代谢途径缺乏统一性。如硝化细菌不能氧化无机硫化物，同样，硫化细菌也不能氧化氨或亚硝酸。

上述各种无机化合物不仅可作为最初的能源供体，而且其中有些底物（如NH4＋ 、H2S、H2等）还可作为质子供体，通过逆呼吸链传递方式形成用于还原CO2的还原力（NADH2），但这个过程需要提供能量，是一个消耗ATP的反应。

与异养微生物比较，化能自养微生物的能量代谢有以下3个主要特点：① 无机底物的氧化直接与呼吸链相偶联。即无机底物由脱氢酶或氧化还原酶催化脱氢或脱电子后，随即进入呼吸链传递，这与异养微生物对葡萄糖等有机底物的氧化要经过多条途径逐级脱氢有明显差异。 ② 呼吸链更具多样性，不同的化能自养微生物呼吸链组成分与长短往往不一。 ③ 产能效率（即P／O）一般低于化能异养微生物。

各种无机底物的氧化与呼吸链相偶联的具体位点，决定于被氧化无机底物的氧化还原电位。不同的无机底物，其氧化后释放的电子进入呼吸链的位置也往往不同。上述这些还原态无机物中，除了H2的氧化还原电位比NAD＋／NADH对稍低外，其余都明显高于它。因此，化能自养微生物呼吸链氧化磷酸化效率（P／O比）比较低。图4-15所示为不同氧化还原电位的无机底物进入呼吸链的可能位点。

图4-15 无机底物氧化时氢或电子进入呼吸链的部位

正向传递产生ATP，逆向传递则消耗ATP并产生还原力［H］

3.无氧呼吸产能途径

无氧呼吸亦称厌氧呼吸。某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下能进行无氧呼吸。在无氧呼吸中，作为最终电子受体的物质不是分子氧，而是NO3－、NO2－、SO42－、S2O32－、CO2等这类外源含氧无机化合物。与发酵不同，无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有氧化磷酸化作用而生成ATP，也能产生较多的能量。但由于部分能量在没有充分释放之前就随电子传递给了最终电子受体，故产生的能量比有氧呼吸少。

在无氧呼吸中，作为能源物质的呼吸基质一般是有机物，如葡萄糖、乙酸等，通过无氧呼吸也可被彻底氧化成CO2，并伴随有ATP的生成。例如：

（1）硝酸盐还原细菌在厌氧条件下，可把NO3－作为电子的最终受体，即：

绝大多数硝酸盐还原细菌以有机物作为电子供体，也有少数硝酸盐还原细菌能利用元素硫或分子氢或硫代硫酸作为电子供体还原硝酸盐。如兼性厌氧的脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）在NO3－存在时，可经无氧呼吸，利用元素硫作为电子供体和NO3－为最终电子受体而还原硝酸盐获得能量：

5S＋6NO3－＋8H2O→5H2SO4＋6OH－＋3N2＋能量

又如兼性厌氧的脱氮副球菌（Paracoccusdenitrificans）在无氧条件下行无氧呼吸，以氢为电子供体，硝酸盐为最终电子受体，还原硝酸盐，进行彻底地反硝化作用：

5H2＋2NO3－→N2＋2OH－＋4H2O＋能量

（2）在厌氧条件下，硫酸盐还原细菌可以SO42－作为最终电子受体，即：

2CH3CHOHCOOH＋H2SO4→2CH3COOH＋2CO2＋2H2O＋H2S＋能量

脱硫弧菌属（Desulfavibrio）等少数几种菌能以有机物（乳酸、丙酮酸等）或分子氢作为硫酸盐还原的供氢体。

（3）严格厌氧的大多数产甲烷细菌可以CO2作为最终电子受体进行无氧呼吸，即：

4H2＋CO2→CH4＋2H2O＋能量

（4）以延胡索酸作为电子受体的无氧呼吸，如雷氏变形菌（Proteus rettgeri）和甲酸乙酸梭菌（Clostridiumformicoacetium）能以延胡索酸作为受氢体还原生成琥珀酸：

HOOCCH＝CHCOOH＋H2→HOOCCH2CH2COOH＋能量

（三）光合作用与光合磷酸化

光合作用是自然界一个极其重要的生物学过程，其实质是通过光合磷酸化将光能转变成化学能，用于还原CO2合成细胞物质。光能营养微生物（phototrophs）除藻类外，还包括蓝细菌、紫细菌、绿细菌和嗜盐菌等光合细菌（photosynthetic bacteria）。它们利用光能维持生命，同时也为其他生物（如动物和异养微生物）提供了赖以生存的有机物。

光能营养微生物的光合作用有两种类型，一种与高等植物类同，而另一种具有细菌特点。一些有关的特性比较见表4-9与表4-10。

表4-9 原核微生物与高等植物光合作用比较

在植物、藻类和蓝细菌的光合作用中，还原CO2的电子来自水的光解，并伴有氧的释放，这类光合作用称为放氧型光合作用。在光合细菌中，光合作用还原CO2的电子来自还原型无机硫、氢或有机物，无氧的释放，把这种类型的光合作用称为非放氧型光合作用。其特点比较见表4-10。

表4-10 两种光合作用类型的比较

光合磷酸化是叶绿素（chlorophyll，Chl）或菌绿素（bacteriochlorophyll，Bchl）的光反应中心接受光能被激发而放出电子，在循环或非循环的电子传递系统中，一部分能量被用于合成ATP的过程。

三类光合微生物在光合作用中的光合磷酸化获得能量的过程与机制不一样。

1.紫硫细菌的光能转化

紫硫细菌是以环式电子传递方式进行光能转化，其过程可分为5步：① 紫硫细菌通过光捕获复合体（Bchl＋类胡萝卜素＋P870，也简称LH，见图4-17），吸收光能。 ② 光被吸收后使反应中心叶绿素P870处于激发态成为P*870。 ③电荷分离，P*870失去一个电子为P＋870，高能电子跃升到电子受体细菌脱镁叶绿素（bacterio-pheophytin，Bph）形成Bph－。④ 电子沿醌铁蛋白（QFe）、Q、细胞色素bc1到C2顺序移动，电子在细胞色素bc1至C2时偶联磷酸化产生ATP。⑤ 低能电子返回到P＋870而形成P870，然后整个系统又接受光量子重复上述过程，见图4-16与图4-17。

紫硫细菌生物合成需要NAD（P）H。当其在氢中生长时，可以利用分子氢直接还原NAD（P）＋为NAD（P）H。在异养生长时，各种氧化还原电位较高的基质对NAD＋的还原一般是由光能推动的。

图4-16 紫硫细菌环式光能电子传递途径

紫硫细菌光能转化的特点是：① 紫硫细菌能利用长波光，Bchl吸收光的峰值为870nm波长处。② 紫硫细菌以环式方式传递电子。 ③ 在异养生长时一般不能直接还原NAD＋为NADH。

光能营养微生物的光合磷酸化是在位于细胞质膜中的类似于呼吸链的光合电子传递链上进行的。其ATP的合成也有赖质子运动力。紫色光营养细菌的光合电子传递途径及光合磷酸化合成ATP的过程与机制见图4-17。

图4-17 紫色光能营养细菌的光合磷酸化途径与机制

（引自Madigan et al.，2006）

2.绿硫细菌的光能转化

绿硫细菌也是以环式电子传递方式进行的，其过程也可分为五步：

① 绿硫细菌通过光合色素（主要是细菌叶绿素c和类胡萝卜素，有的还伴有细菌叶绿素d和e）吸收光能。 ② 使反应中心的叶绿素P840处于激发态成为P*840。③ 电荷分离使P*840形成P＋840和一个电子，这个高能电子跃升到电子受体Fe-S蛋白上，使Fe-S蛋白（E0＝ －540mV）被还原。 ④ 电子由Fe-S蛋白经醌类（MK，CQ），细胞色素b传到C555。电子在细胞色素b至C555时偶联磷酸化产生ATP。⑤ 低能电子返回到P＋840形成P840。整个系统又接受光子重复上述过程，见图4-18。

绿硫细菌光能转化的特点是：① 绿硫细菌的Bchl吸收光的峰值在840nm处。 ② 绿硫细菌是环式电子传递方式进行的。 ③ 绿硫细菌通过Fe-S蛋白能直接还原NAD（P）＋为NAD（P）H。

图4-18 绿硫细菌环式光能电子传递途径

3.蓝细菌的光能转化

蓝细菌的光能电子传递是非环式的。从水到NADP＋的非环式电子传递是一个短波光合系统Ⅱ（PSⅡ）。它含有作为主要光捕获色素的新藻胆蛋白，并在氧化水的同时放出氧和还原质体醌；还原NADP＋的电子传递是通过细胞色素链和长波光合系统（PSⅠ）进行的。蓝细菌的光能电子传递见图4-19。

从图4-19可见，在光合系统Ⅱ（PSⅡ）中藻蓝素（Phc）和藻红素（Phe）吸收光子并把能量传递给异藻蓝素（aphc），再把能量传递给反应中心叶绿素（P680），由水提供电子还原质体醌（PQ），再经电子传递链，从b559到f至PC，电子经b559到f时偶联产生ATP。低能电子通过PSⅠ中的叶绿素a吸收光能使电子在P700处受到激发去还原Fe-S，再通过可溶性铁氧还蛋白和铁氧还蛋白-NADP＋还原酶最后传至NADP＋。

蓝细菌光能转化的特点是：① 电子传递一般不成闭合途径。 ② 电子由外源电子供体提供。 ③ PSⅡ具有光解水放氧的作用，并经电子传递偶联产生ATP，PSⅠ把电子还原Fe-S经Fd和FP使NADP＋还原为NADPH。

可以看到，蓝细菌中的非环式电子传递，不但能产生ATP，而且还能提供NADPH，在这类光合细菌中，具有对ATP和NADPH合成的调节功能。当体内需要还原型NADPH时，在外源供氢体帮助下进行非环式电子传递作用。当细菌不需要还原性NADPH时，或者由PSⅠ产生的电子能量不足以还原NADP＋时，则按环式电子传递方式为细胞提供ATP。

图4-19 蓝细菌的非环式光能电子传递途径