放射免疫分析

【原理】　放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）的基本原理是，限量标记抗原（＊Ag）和可变量的非标记待测抗原（Ag）与定量的特异抗体（Ab）发生竞争结合反应，通过测定复合物的放射性来计算出待测非标记抗原的量。这一过程可用下式表示：

上述式中，Ab的分子数少于＊Ag，因此即使系统中没有Ag，仅有＊Ag，当反应达到平衡时，绝大部分（因为是可逆反应，不会是100%）Ab将形成＊AgAb复合物。如果系统中加入Ag，则Ag与＊Ag竞争结合Ab，形成AgAb，＊AgAb将减少。Ag越多则＊AgAb越少。实践和理论推导都证明，＊AgAb和Ag呈二次方程的函数关系，如以Ag为横坐标，＊AgAb（B）或＊AgAb占加入总＊Ag的百分比（B%）为纵坐标，是一条斜率逐步由大变小的下降曲线。如以游离的＊Ag（F）或游离＊Ag占加入总＊Ag的百分比（F%）为纵坐标，则是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。也可以＊AgAb与＊Ag的比值（R）为纵坐标，也是一条斜率逐步由大变小的上升曲线。

分析中，首先以不同量的已知标准品Ag和定量＊Ag及限量Ab进行竞争结合反应，得到以B或B%、F或F%、或R为纵坐标的剂量效应曲线（也称标准曲线），然后以未知样品测得的B或B%、F或F%、或R从曲线上查出相应的剂量。

【试剂盒】　试剂盒由国家批准的生产单位提供，提供RIA的主要试剂、操作方法、保存条件及保存期限。使用者应按说明书的要求合理使用。如果临床工作需要，使用者可以对试剂稀释度、操作步骤等进行适当修改，但应当对改变了的方案进行精密度、准确度、灵敏度等考核，并作详细记录。

一般试剂盒都包括3种主要试剂：抗体、标记抗原、非标记标准抗原（标准品），很多试剂盒还提供分离试剂或材料、缓冲液及质量控制用的样品。

1．抗体　一个好的抗体应具备3个条件，即高亲和力、高特异性、高滴度。高亲和力的抗体是高质量RIA的前提。只有这样的抗体才能获得高灵敏度和高精密度的标准曲线。高特异性也非常重要，样品中往往含待测物质结构相近的类似物，如果抗体特异性不高，则类似物也能与抗体结合，成为干扰物质，影响分析结果。

目前，RIA用的抗体大多由专门的研究单位或生产RIA试剂盒的厂家提供。可以是多克隆（polyclonal），也可以是单克隆（monoclonal）抗体。一般说前者容易获得高亲和力，后者的特异性更好，而且后者可使抗体的来源得到长期保证。

对RIA的使用者来说，更重要的是能了解抗体的主要性能。亲和力的测定最常用的方法是Scatchard作图，得到以AgAb的浓度为横坐标，以B／F为纵坐标的直线，直线的斜率即－Ka。

2．标记抗原　对标记抗原的主要要求是：①比活度和放化纯度必须足够高，以保证分析的灵敏度；②半衰期不能太短，以便完成运输、保存和整个分析过程；③不改变原有抗原的特性（特异性、亲和力、免疫活性等）。基于以上要求，目前大分子抗原（蛋白质）主要用125I标记。小分子半抗原可选125I或3　H。用125I标记蛋白质，应使每一蛋白分子不超过一个原子的125I，125I过多可导致蛋白质免疫活性或其他特性的变化。标记方法应较温和，强氧化或强还原反应易使蛋白质性质发生变化。3　H标记半抗原可以每一分子达1～4个3　H原子甚至更多，但也须保证不改变抗原的特性。

3．标准品或校准试剂　标准品是定量的依据，要求纯度尽量高，配制时浓度应准确，并注意保存。

4．质量控制样品　质控样品（QC　pool）是专为质控而制备的与待测样品性质相同（例如最常用者为人血清样品）而含量为已知的样品。它们在偏差和漂移的监测中起着决定性作用。对质控样品的基本要求是：在分析的全过程中与待测样品有相同的行为特点；制备和保存必须有良好的稳定性和重现性；应有足够的量供长期使用，新旧两批质控样品交接时必须平行测定至少两次，以保证它们的连贯性；应包括与标准曲线使用范围相呼应的高、中、低三种剂量。

5．分离试剂和材料　放射免疫分析中，绝大多数情况是保留和测定复合物的放射性，除去游离抗原。少数情况是除去复合物，测定游离抗原的放射性。游离抗体无放射性，不干扰测量，是否除净并不重要。分离方法可分两大类，分述如下。

（1）抗原抗体在液相环境中起反应，终止反应时用一定方法收集复合物测量放射性。常用者有双抗体沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法或PEG与双抗体法联合使用、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法等，使复合物沉淀测定B部分。另一种吸附分离，用右旋糖苷包被活性碳（称DCC）或其他吸附剂，吸附小分子抗原，离心后复合物留在上清液中供测量。

（2）另一类方法是预先将抗体吸附在某种固体支持物上，抗原抗体反应就在支持物上进行，反应结束后只需将周围未结合的游离抗原洗去，测定固体支持物上的放射性。很多材料可供选用，如塑料（聚乙烯、聚苯乙烯、尼龙等）、纤维素、凝胶颗粒（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）、多孔玻璃微球。

固相分离法是RIA近年来发展较快的领域。例如磁性颗粒法将固相颗粒（如纤维素）与含铁化合物（如氧化铁）连接，再与抗体连接，此种颗粒在磁场吸引下不需离心即可与游离标记抗原分开。

【测定方法】　RIA的操作一般都包括加样、孵育、分离结合和游离部分、测放射性、数据处理等5个步骤。

1．加样　在冰浴（有的系统可在室温）中进行，一系列试管中加入相同剂量的抗体、相同剂量的标记抗原、不同剂量的标准抗原（作标准曲线）或一定量样品。有2种方式：一种是经典加样法，即抗体、抗原及标准抗原或样品全部加完后开始孵育。一种是顺序加样法，即先加抗体和非标记抗原或样品，孵育一定时间后再加入标记抗原。后一种加样法可以提高非标记抗原竞争抗体的能力，因而灵敏度有一定提高，但稳定性（stability）和重现性（reproducibility）较差。此外，还应有非特异结合（non－specific　binding，NSB）管，不加抗体，只加标记抗原，测得的放射性代表分离材料对标记抗原的非特异性吸附。所有试管测得的总结合减去非特异结合才是抗原抗体的特异结合。

全部试管的加样总体积应一致，并保持一定的pH，因此试剂都以同一缓冲液配制，并以同一缓冲液将各管补足到相同体积。不同系统都有一个获得最高结合的pH值范围，多数为7．4～7．7，但也有例外，应通过预实验选定。

2．孵育　不同分析对象反应达到平衡所需孵育时间和温度不同。有的随温度降低而亲和力提高，分析灵敏度也提高，有的则温度对Ka的影响不大。但是，温度降低将使达到平衡的时间延长，所以选用什么孵育温度应衡量所需的灵敏度及临床需要检验报告的缓急来选定。选定后不可随意变动。时间到达后转入冰浴等待分离。

3．分离结合和游离部分　参照前面所述，从众多分离方法中选用一种，将结合和游离部分分开。

4．测放射性　如果是125I抗原，通常都可直接用NaI闪烁计数器测量cpm值，如果是3　H标记抗原，往往需要将样品加至闪烁液作均相、乳状液、或固相测量。同一批样品和标准品的测量效率相同，通常不必将cpm换算成dpm。

5．数据处理　上述测量到的结果最后须换算成待测物的量或浓度，现已有各种计算机软件供选用。使用者应当尽可能选用较先进的软件，使换算结果更为可靠，将在下面进一步讨论。

【主要技术指标】

1．灵敏度　统计上能与零剂量相区别的最小量。所以灵敏度主要取决于零剂量的标准差（s），如欲比较不同系统的灵敏度，可以直接比较他们的零剂量s。

2．准确度　准确度是指样品的测定值偏离真值的程度，由于实际样品的真值是未知的，常用的估计准确度的方法是测定实际样品外加标准品的回收率。多次测定的外加标准品回收率平均应接近100±10%，且变异系数不大。准确度有时随剂量而异，最好测定高、中、低三种剂量标准品的回收率。

3．精密度　是指同一样品重复测定的实测剂量（不是cpm）的离散程度。离散程度越小，则能区别的样品量差别越小，也就是分析系统的精密度越高。通常以复管的变异系数（CV）表示。一批实验的平均CV（ABCV）为各样品CV的平均值，通常要求批内和批间的CV分别＜10%和15%。但是CV和待测物的量有关，如两批样品含量分布不同，ABCV就缺乏可比性。更好的办法是精密度的剂量分布图，简称作精密度图（precision　profile）。精密度图通常都是两侧的变异系数大，中间有一可以接受的范围。精密度图需要较大量的样品数才有代表性。

4．特异性　指类似物的交叉反应，主要由抗体的特异性决定。交叉反应大小常以标准品和类似物抑制结合率50%所需浓度EC50的比值来定量。例如某一系统标准品EC50是1pmol，某一类似物EC50是500pmol，交叉反应就是1∶500。

5．非特异结合率　主要由分离材料等引起的放射性计数，不是抗原抗体特异结合形成的结合率。一般要求PEG分离法＜10%，各种第2抗体和固相分离法＜5%。

6．剂量－反应曲线和工作范围　前者按四参数Logit／Log数学模型计算得到的线性相关系数应＞0．99。工作范围选用10次以上重复实验的精密度图中CV＜15%的剂量范围。

【质量控制】　质量控制的目的就是对分析工作的误差进行经常性的检查，遇有质量异常则及时采取对策，以保证分析误差控制在可接受的范围内。放射免疫分析的质控包括实验室内部质控和实验室间质控两个方面。前者是一个实验室对本身的分析质量进行检查和控制，后者则由地区性或全国性机构就一些项目对各实验室的结果进行比较，得到共性或个性的信息，提供行政主管、生产厂家、各有关实验室参考。

1．实验室内部质控的主要内容　实验误差分两大类：随机误差及系统误差。前者的出现纯属随机现象，例如因各样品加样、分离、测量等步骤的差异引起复管差异过大。后者的出现则是由于整批实验发生了某一系统变化，使很多样品受到类似的影响，例如标准品浓度不准或待测样品所用加样器不准，结果所有待测样品都偏低或偏高。随机误差是不可避免的，只能将之控制在可接受的范围内，而系统误差则是可以而且应当设法避免的。实验室内质控就是要对这两类误差进行监控。由于监控的多数指标并无固定值作为客观标准，通常由计算机储存过去10～20批无明显异常的实验数据，取均值作为“正常参考值”，亦可称为“期望值”。

监控的内容主要有以下几方面。

（1）标准曲线的质量：主要包括拟合参数的重现性、拟合优度检验。标准曲线的拟合参数的重现性不良往往是由于抗体、标记抗原或标准品变质或用量有误。监测重现性可以帮助发现问题，分析原因，如有标准品变质或用量有误，应当改正后重测。拟合优度由平均残差或平均残差平方监测，若某批实验平均残差或平均残差平方特别大，F检验与期望值与以往有显著差异，则往往说明有突出值（亦称坏点，outlier），应去除后重新拟合，如果不能明确突出值是哪一点，则应当对整批实验重新测定。此外，还应注意，RIA的标准曲线只在所用标准品量的范围内有效，外推法得到样品量，如超出最低或最高标准品量，都只能作参考，不能作为有效结果。

（2）精密度检验：应当先计算每一样品复管实测剂量的CV，如果有些样品CV超过一定值（一般定在7%～10%），则说明该样品的测定结果可信度很低，应重测。在测得每一样品精密度的基础上，可以计算整批平均精密度ABCV，并作精密度图，以从整批实验的高度检验精密度是否正常，以及样品含量在什么范围结果是可靠的。但是ABCV和精密度图都需要较多数据且含量分布比较均匀才有意义。精密度的检验是质控中极为重要的内容，是检测随机误差最重要的指标，但是必须有复管才能进行，对于有重要临床意义或重要科研意义的样品，不做复管测定是不对的。

（3）整批实验的偏差：偏差是指整批样品的测定值由于同一因素而出现类似的误差，其检验主要依赖质控样品。质控样品（QC　pools）是已知含量的样品，专门为质控而制作，预先分装，妥善保存，可供多次使用。每批实验选高、中、低含量的三个样品，与未知样品同样处理，而且每一含量分成2份或3份，分别排在一系列待测样品的起始、中间（待测样品较少时可略去）和末尾，同样做复管。测定结束后计算每种含量QC样品的实测含量及其均值。如果在期望值（过去若干批的均值）±2s的范围内，则表示没有明显的系统偏差。如果QC各含量样品测定值都向同一侧超出期望值±2s的范围，则强烈提示本批实验有系统偏差，应当舍弃后重做。

（4）漂移：漂移是指一批实验中样品很多时，由于试剂失控（例如抗体或标记抗原温度控制不严）或样品失控（例如待加样的样品温度过高），以至从先加样的样品到后加样的样品逐个发生渐进式的偏差。漂移的监测是比较同一QC样品前后2次或3次测定值，如果有显著差异，而且各含量QC样品变化的方向一致，则提示漂移的存在，严重时应舍弃重做。

（5）批间质控：批间质控主要是选择一些重要指标，每批实验进行监测，逐批累积起来，并作成一定的图形。这种监测的第一个作用是可以作为“期望值”，用于批内质控。它的第二个作用是可以观察是否有轻微但是确实存在的系统性变化，这种变化可能对临床上前后对比的观察带来严重影响，例如本来前后对比无差异的病人可能因为批间有渐进性的偏差而变成有差异。最常用的作图是Shewart图和Cusum图。前者用于观察每批的实测值有无差异以及差异有多大，后者则把微小的但是确实存在的系统差异累积起来，用于观察变化的趋势。

2．计算机管理　上述实验室内部质控现在已经完全计算机化，也就是整个质控都由计算机计算、储存、和调用。临床工作者的任务是了解这些质控内容的意义，有目的地选用，并且不是形式化地，而是有效地用于提高分析质量。

【数据处理】　数据处理是将实测结果（放射性计数）在标准曲线上换算成标本中待测物的量。目前应用的主要是以质量作用定律为基础的几种数学模型。

1．Logit－Log模型　标准管的剂量为X（X1，X2，……），Bo为X＝0时的结合率，Bx为X＝X1，X2，……时的结合率，若以Log　Bx／（Bo－Bx）为纵坐标，Log　X为横坐标，得到一条逐步下降的直线，其数学表达式是：

通过最小二乘回归求得a和b，代入上式，再以待测样品的Bx逐个代入上式，即可求得各样品的含量X。本法优点是简单，用计算器也可拟合，缺点则是：①Log　0无解，拟合时丢掉0剂量点，降低了灵敏度；②如有突出值，整条拟合线会偏离；③在顺序加样法中不是直线，不可用。

2．四参数Logistic模型　本法从Logit－Log法演化而来，其函数式如下：

式中Y是各实验点的结合率（包括NSB），X是各点的剂量。a、b、c、d是四个参数。a代表0剂量时的结合率（包括NSB），b代表Logit－Log函数中的斜率（拟合时先由计算机求出），c代表结合率（减NSB）降低一半时X的剂量，d代表NSB。上式由最小二乘法对各标准管的实测数据拟合得到a、b、c、d，再将待测样品的实测数据代入，求出含量。本法通过拟合求NSB，而且不丢失0剂量点，所以优于Logit－Log法。但是①理论上可导出，本法只适用于平衡法，若要用于顺序加样法，应略加改变，变为五参数Logistic模型；②也会受突出值影响而偏离。

3．四参数质量作用定律模型　本法的特点是：①采取稳健回归法进行曲线拟合，在大多数情况下能排除标准曲线突出值的干扰；②严格根据质量作用定律推导；③把非特异结合作为与游离标记抗原成比例的参数引入模型的函数，不必事先减去；④不仅适用于平衡法，也适用于顺序加样法。其函数式如下：

R2［b（c＋p＊＋X）＋q］＋R［c（b－1）＋q－p＊X］－c＝0式中c＝1／Ka，p＊＝标记抗原初始浓度，q＝抗体初始浓度，b＝NSB所占游离抗原的%，R＝F／B，X＝标准品或待测物的量。