免疫分析法

免疫分析法(immunoassays)的原理是被分析药物(Ag)和标记后的该药物(Ag*)与该药物的特异性抗体(Ab)竞争有限的结合部位，未标记药物(Ag)的浓度决定于标记药物(Ag*)与特异性抗体结合的量。标记物可以是放射性同位素、酶、荧光物质或化学发光物质，依据标记物的属性，测定其放射性、酶反应后的UV吸收和荧光强度。免疫分析法具有较好的特异性、灵敏度，操作简便，特别适用于生物技术药物的分析。较为常用的有:酶联免疫分析法、放射免疫分析法和免疫放射分析法等。

11.4.2.1　酶联免疫分析法

酶联免疫分析法(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)在生物技术药物分析中的应用有两个方面:①以酶为分析对象，根据需要对生物技术药物生产过程中所使用的酶和生物技术药物样品所含的酶进行酶的含量或酶活力的测定，称为酶分析法。②利用酶的特点，以酶作为分析工具或分析试剂，用于测定生物技术药物样品中用一般化学方法难于检测的物质，如底物、辅酶、抑制剂、激动剂或辅助因子含量的方法。酶分析法的专一性使得当待测样品中含有结构和性质与待测物十分相似的共存物时，进行分离纯化往往非常困难。而如果使用仅作用于被测物质的酶，利用酶的特异性，不需要分离就能辨别试样中的被测组分，从而对被测物质进行定性和定量分析。酶联免疫分析是将酶分析和免疫分析联用，在抗体或抗原分子上连接酶分子，进行免疫反应，免疫复合物上的酶将特定的底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，由颜色的深浅确定待测物的量，其催化底物可与核素一样起到信息放大的作用，具有很高的灵敏度，检测下限可达到ng甚至pg水平，有效期远远超过125 I标记物，而且能减少放射性废物。

ELISA特异性强、灵敏度高，可广泛应用于蛋白质和多肽类生物技术药物的药动学研究。主要的实验步骤分为:包被、洗涤、与特异性抗体反应、与酶联抗抗体反应、显色和测定。

刘秀文等应用ELISA研究静脉推注加滴注重组人碱性成纤维细胞生长因子后的药代动力学行为特征，获得药代动力学参数;曾衍霖等用ELISA法对重组新型人白细胞介素－2进行了大鼠体内药物代谢动力学的研究;鞠洋等应用ELISA研究新型重组人肿瘤坏死因子在小鼠体内的药动学特征，得出肿瘤坏死因子肌内给药的生物利用度为48.84%，可考虑作为替代静脉的一种安全给药途径。

在ELISA中有一种双抗体夹心法能够选用单克隆或多克隆抗体，甚至两者可以同时使用，原理是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上的两个抗原决定簇结合，形成固相抗体－抗原－酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶作用于相应的底物后生成的有色物质的OD值，即可确定待测抗原含量。陈金武等次用2株高亲和力、高特异性的单抗，建立了双抗夹心ELISA法检测聚乙二醇化重组人生长激素的浓度，定量限可达1μg·L－1。马国昌等采用双抗体夹心ELISA测定血清中的重组人集落刺激因子(rhG－CSF，商品名:吉粒芬)、聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG－rhG－CSF)和重组人血清白蛋白－粒细胞集落刺激因子融合蛋白(rHSA－hG－CSF)的血药浓度，对比它们在小鼠体内的药代动力学行为。

11.4.2.2　放射免疫分析法

放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)是最早建立的一种免疫分析法，是放射性同位素测定法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。其原理是用已知的抗原与标本中可能存在的抗原竞争一定量的已知抗体，分别形成标记的和无标记的抗原抗体结合物。再经某种途径分离结合的和游离的标记物，并根据测得的放射性强度，算出结合率，与标本中抗原的量成反比。该法具有灵敏度高、特异性强、标记物容易制备以及放射性强度容易检测等优点，特别适合复杂样品中微量或痕量物质的分析，在体内药物分析中占有十分重要的地位。临床上使用放射免疫分析法测定胰岛素及C－肽的含量来诊断2型糖尿病;Venturini等用RIA法测定健康志愿者体内的黄体生成素。

放射免疫分析法具有低本底和高灵敏度、不受周围环境和样本内干扰物质的影响、与小分子量同位素的结合不影响免疫反应、具有完善的放射测量体系等优点。同时，由于同位素的半衰期使得试剂盒具有一定的使用期限而不便储存，结合与抗原或抗体分子上的125 I分子有限，过高会引起结合物的自照射分解，试剂的使用、购买以及废物处理等均引起一定的辐射安全问题。

11.4.2.3　免疫放射分析法

免疫放射分析(immunoradiometric assay，IRMA)是在放射免疫分析发展的基础上，随着单克隆抗体的出现及固相化技术的巩固和发展，出现的以标记过量抗体与被测抗原或被测物的非竞争结合为基础的分析方法。IRMA法的基本原理是试验时受检抗原与过量的标记抗体反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂，以结合游离的标记抗体，经离心后测定上清液中的放射性强度，从而推算出标本中抗原的含量。IRMA分析法快速、准确和有高度的特异性，临床上可用来测定胰岛素样生长因子(insulin－like growth factor I，IGF－1)以监测成年人和儿童体内生长激素(growth hormone，GH)的缺乏或过量，还可以用来测定血清促甲状腺激素(TSH)以检查甲状腺功能，诊断甲状腺功能疾病。

11.4.2.4　化学发光免疫分析

化学发光免疫分析(chemmiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶等的检测分析技术。它由两部分组成，免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应依然是利用特异性的抗原－抗体结合反应，将标记物质直接标记在抗原或抗体上，经过反应后，形成抗原－抗体复合物，然后采用相应标记物的检测方法进行检测。化学发光分析部分是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器光量子产率，从而进行分析。根据标记物的不同，化学发光免疫又可分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。

电化学发光免疫分析技术结合了抗原抗体反应的高特异性和电化学发光检测的高灵敏度，适用于对生物组织、体液等复杂生物样品中极低含量的生化物质及药物的分析。电化学发光是通过在电极上施加一定电压以引发电化学反应，电化学反应释放的能量再激发发光体，当激发态发光体返回基态时便产生光发射，从而可以根据光发射强度来实现对被测物的分析。目前基于电化学发光免疫分析原理的检测仪器已成功商品化，如罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)的Roche Elecsys型电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒，可快速检测多种疾病标志物。Yan等人利用电化学发光免疫分析法成功检测人血清中p53抗体;另外还有促卵泡激素、催乳素等酶促化学发光免疫分析试剂盒。Wilson等人将生物素及2，4，6－三硝基甲苯(TNT)结构类似物结合到氨基化葡聚糖上，制备了抗原修饰的葡聚糖，并基于竞争免疫分析原理，加入电化学发光反应溶液，产生电化学发光用于分析TNT的含量，检测限达到了31ppb。Yin等人通过金电极表面上修饰的纳米金增大了抗体的固定量，并采用4－(二甲基氨酸)丁酸作为示踪抗体的标记物，在电化学发光及Ru(bpy)32+的存在下，实现了对人IgG及牛血清白蛋白的测定。

11.4.2.5　荧光免疫分析法

荧光免疫分析(fluorescence immunoassay，FIA)是以荧光物质作为标记物与待测药物结合，所形成的荧光标记药物能与抗体发生免疫反应，引起荧光强度发生变化，通过对荧光强度的测定来进行分析的一种免疫分析方法。荧光免疫分析可分为时间分辨荧光免疫分析、荧光偏振免疫分析、荧光淬灭免疫分析、底物标记荧光免疫分析、荧光增强免疫分析等。

时间分辨荧光免疫分析是荧光免疫分析中的时间－分辨测量技术，通过测定标记物和干扰物荧光寿命的差异，选择性的测定标记物的荧光信号，在临床诊断中发挥着重要作用。如采用时间分辨荧光免疫分析法测定血清中甲胎蛋白的含量，用于肝癌的诊断;测定血清中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)来诊断乙肝，方法优于传统的酶标法，可有效排除非特异荧光信号，动态范围宽、稳定性好、易于自动化;检测新生儿血液中促甲状腺素的浓度用于诊断原发性甲状腺功能减低症，并有相关试剂盒的研发及应用。

免疫分析法具有高特异性的优势，但是免疫学方法的主要缺点是:不能够对生物技术药物作出完全的鉴定，如确切的生化组成和氨基酸序列等;也不能区别生物技术药物的活性形式和无活性形式;生物技术药物的部分降解可能改变或消除它与探针抗体的相互作用;不能够同时测定生物技术药物及其代谢产物;受到大量的内源性或外源性物质如结合蛋白质、代谢产物、抗体形成或混合物的干扰等。因而，在目前的各项研究工作中，以各种分析方法综合使用为主。