放射免疫分析标记抗原的制备

1.标记抗原的制备

放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其他元素的不稳定同位素。RIA实验中所需放射性同位素一般要满足以下要求:

(1)足够的放射性强度。放射性强度指的是每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变(desintegration per－second，dps)，其单位为贝可(Bq)。用于标记抗原分子的放射性同位素要发出足够强度的射线，方能满足检测需要。

(2)适当的放射性比活度。放射性比活度又称比放射性，指的是放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度。放射性比度的单位为mci/g或mci/mL，一般来说由于分子量足够小，常用放射性元素中3 H的比活性相对较大。

(3)一定的放射性化学纯度(放化纯度)。放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比。一般实验要求放化纯度大于90%。

2.放射性同位素的选择和特点

常用来标记抗原的放射性同位素包括3 H、14 C、125 I、131 I等。如表7－1所示，每种放射性同位素的发射射线种类、能量等均有所差异，因此在实际应用中需要进行甄别使用。在日常的标记工作中最常使用的是3 H和125 I。

采用3 H标记的优点是:由于比放射性高，需要试剂量较小;由于氢原子直径较小，标记后药物的抗原决定簇不易被覆盖或者掩藏，因而抗原性不会受到影响;半衰期较长;3 H只能与1 H交换，故不存在化学元素的改变。缺点是:由于发射的β射线的能量较低，测量难度较大，一般需要价格昂贵的液体闪烁计数器方能测定其放射性强度。

采用125 I进行标记的优点是:125 I的化学性质较为活泼，易于标记抗原;125 I发射的γ射线能量较高，测定较为容易。缺点是:半衰期较短，需多次标记;原子半径较大，易掩埋抗原决定簇，使得药物分子的免疫原性削弱或者改变。

表7－1　常用标记同位素的性质比较

3.对标记抗原的要求

一般来说，标记抗原需符合以下要求:比放射性高，以保证方法的灵敏度;实验要安全，易于防护;所用核素的半衰期尽可能长，保证足够的测量时间;标记简便。要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用标记抗原的量，在使用125 I时达5000～15000 cpm;稳定性良好，且有合适的方法或者试剂能分离B与F;免疫活性好。以125 I标记抗原为例，蛋白质分子上标记过多的碘原子就可能引起免疫活性的改变，一般以每个蛋白质分子上只标1～2个125 I原子为宜。

4.抗原的标记方法

3 H标记抗原的方法:按照标记方法的不同可以简单地分为定位标记和非定位标记两种。非定位标记只需要将氚气和药物置于同一密闭装置中，放置足够长时间，待标记完全后即可。定位标记则需要将3 H分子引入药物分子中的特定位置，得到具有不饱和双键的标记药物中间体后，再经催化反应得到目标标记药物。

125 I标记抗原方法:大分子药物可直接采用放射性碘标记，小分子物质一般采用氧化法标记，即先将药物制成含酪氨酸、组氨酸或酚基的衍生物，然后再进行标记，使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代。其中以氯胺T法最为简便，效果好，易于采用。氯胺T碘化标记法的原理是:氯胺T是一种氧化剂，可以在水溶液中缓慢地释放出次氯酸，在标记的过程中形成一种能产生温和氧化作用的中间体，它可使放射性碘离子氧化成性质活泼的碘离子，并取代抗原分子中酪氨酸苯环羟基邻位的一个或两个氢原子，使之成为含有碘化酪氨酸的多肽链。