微生物分子免疫学实验－斑点免疫渗滤分析

实验三十　微生物分子免疫学实验－斑点免疫渗滤分析

一、实验目的

（1）学习血清学试验的一般规律、影响因素。

（2）学习抗原或抗体检测常用的检测方法。

（3）尝试针对不同对象，自主设计检测方法。

二、实验原理

斑点免疫渗滤分析的免疫反应是通过垂直穿透固定有配体的硝酸纤维素膜而进行的。加样品于固定有抗体或抗原的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体—抗原复合物，洗涤渗滤后，再加液体的胶体金标记抗体。当结果为阳性时，在膜上固定有抗体—抗原—胶体金标记抗体复合物而呈现红色斑点。如样品中无抗原，则不被捕获，就不显色，则结果为阴性。该方法简单快捷，灵敏度高，准确性强，可广泛应用于各类定性快速检验。

人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白，由α和β二聚体的糖蛋白组成，常用于各医学检测或作为免疫学实验阳性样本。本实验以HCG为例进行斑点免疫渗滤分析实验。

三、试剂与器材

胶体金标记鼠抗α－HCG抗体，鼠抗β－HCG抗体，羊抗鼠抗体，硝酸纤维素膜，滤纸，洗涤液，HCG阳性标本

四、实验步骤

（1）将硝酸纤维素膜剪成约25mm×25mm大小的片状，放在相同大小的滤纸上。

（2）在硝酸纤维素膜上分别点样：羊抗鼠抗体和鼠抗β－HCG抗体溶液，形成质控区与检测区（如图30－1）。

图30－1　免疫渗滤示意图

（3）在45℃烘箱中加热约2h，固定样品。

（4）在硝酸纤维素膜上滴加HCG阳性标本。

（5）在硝酸纤维素膜上加液体的胶体金标记抗体，反应3min。

（6）用洗涤液冲洗后读取结果。

五、实验结果记录

如图所示：

六、思考题

（1）试分析出现无效结果的原因可能有哪些？

请根据此实验方法，针对本学期实验中检测过的目标产物设计定性或半定量快速检验方案。