鼠疫放射免疫沉淀试验（）

第四节　鼠疫放射免疫沉淀试验（RIP）

鼠疫放射免疫沉淀试验具有灵敏度高和特异性强的特点，在鼠疫自然疫源地的调查及鼠疫流行病学的调查中起着关键性的作用。

一、基本原理

放射免疫沉淀试验（RIP）的原理：当被检血清（以及血浆、全血、脏器浸液等）中含有鼠疫F₁抗体时，它与F₁抗原作用，发生免疫学反应，生成抗原—抗体复合物。当F₁抗原被放射性同位素标记后，其抗原—抗体复合物也必然带有放射性，并且其放射性量直接反映出复合物的量，即直接反映出被检血清中F₁抗体的量。可用下式表示：

＊F₁抗原＋F₁抗体葑＊F₁抗原—抗体＋＊F₁抗原

RIP是用分离剂沉淀抗原—抗体复合物，故能够检测出不完全抗体，从而提高RIP的敏感性。RIP是目前鼠疫血清诊断中最敏感、最特异的方法之一。是鼠疫动物病监测中首选的血清学检测方法。

二、试剂和材料

1．I¹²⁵－F₁抗原

2．分离剂　金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）制成10%菌悬液。

3．稀释液（工作液）　1%正常兔血清盐水4份加0．1mol／L EDTA－Na₂1份之混合液。

4．吸液管，反应管，小试管架，水浴箱，离心机，检测仪器等。

三、方法

一般分为两步。

1．初筛　大部分被检血清样品是不含鼠疫F₁抗体的，因此为了节约人力、物力，减少不必要的浪费，要求对收集的血清样品进行筛选试验，对有反应的血清，进一步复查，测其终效价。但对个别血清量过少的样品，可直接用复判的方法去测定。在试验前如能用56℃30min灭活，则效果更好。

筛检时将被检血清用工作液稀释为1∶10和1∶100两种含量做双管测试。

（1）稀释被检血清：取5μl被检血清加入第一管0．45ml工作液中，混匀后从此管取50μl加入第二管0．45ml工作液中混匀，从此管取50μl弃去。

（2）加标记抗原：每管加50μl含15000～20000之间的I¹²⁵－F₁抗原溶液，混匀。

（3）37℃水浴1．5～2h。

（4）加分离剂：每管加10%SPA 1滴（1ml吸管加20滴）混匀置室温30min。用于能被SPA吸附的血清。

（5）测总放射性（T）：时间为30s。

（6）离心沉淀：1000r／min 15min，吸净上清。

（7）测沉淀物放射性（B）。

（8）计算结合率B／T×100%。

在做以上试验的同时应设空白对照（工作液I¹²⁵－F₁＋SPA），以资验证非特异性反应和阴性对照（加入与被检血清同源的正常血清1∶100）稀释正常血清加I¹²⁵－F₁＋SPA，每批次试验（含若干例同源被检血清样）设5～10管对照。

2．复判　经初筛后认为是有反应的血清（被检血清之结合率比阴性对照管的结合率大于或等于3倍）；不论其滴度如何，需用放射免疫沉淀抑制试验（RIPI）复判。

将复判血清从1∶10开始行连续倍比稀释两组，其中一组（RIPI组）每管加100μg／ml F_I抗原50μl混匀。另一组（RIP组）不加，37℃温育15min后，两组各管内分别加入50μl之I¹²⁵－F₁抗原溶液，混匀后按前述方法水浴，加分离剂，测放射性，计算结合率等。如RIPI组与RIP组比较，能抑制3管或5管以上，则抑制试验成立，说明RIP为特异性反应。

在行上述试验的同时，应设相应的阴性对照组，与被检血清组比较，设阳性对照，以证实本次实验的可靠性。

3．结果判定判定　血清学反应的结果，一般包括两个标准，即反应标准和诊断（滴度）标准。

反应标准是指某个稀释度有阳性反应。RIP试验的反应标准为试验组各稀释度的B／T值与相应稀释度同源正常血清（阴性对照管）之B／T值的比较（即结合率比）大于或等于3倍；确诊试验至少抑制3管或5管以上，特异性反应成立。

诊断标准是指该试验阳性例之阳性滴度标准。即对该种疾病需多高滴度才能诊断为阳性例。其判定标准的依据是：①要高于有类属反应的滴度。②要高于正常滴度（或高于正常滴度加2或2．5个标准差）

参照全国科研协作组（1988）的报告，各种血清的诊断标准不能完全一致，黄鼠疫的诊断滴度标准为≥1∶320，旱獭、长爪沙鼠、黄胸鼠及犬为≥1∶80。由于鼠疫的自然疫源性决定了它的特殊性和复杂性，所以目前的诊断标准，尚有待于实验的检验。