酶免疫分析

【原理】　酶免疫分析（enzyme　immunoassay，EIA）的原理与RIA和IRMA相同，不同的是用酶替代放射性核素标记抗原或抗体，经竞争性或非竞争性免疫结合反应，产生的免疫复合物，其中的酶催化特定底物，生成有色产物，可根据有色产物的吸光度不同来对受检样品作定性或定量分析。常用的酶标记物：

1．辣根过氧化物酶（horseradish　peroxidase，HRP）　用于EIA的主要是HRP的C型同工酶。HRP首先与H2O2结合形成活泼的“氧化剂”，再催化底物氧化生成显色产物。HRP的常用底物有：邻苯二胺（OPD）、5－氨基水杨酸（5－ASA）、四甲基联苯胺及其硫酸盐（TMB、TMBS）、邻联甲苯胺（OT）等。

2．碱性磷酸酶（alkaline　phosphatase，AP）　AP系水解酶，将不同的磷酸酯水解使之成为有色产物。常用底物为对硝基酚磷酸酯（p－NPP）、酚酞单磷酸酯（phenolphthelein　monophosphate）。

【分类】

1．按免疫反应后是否分离结合抗原（B）和游离抗原（F）

（1）均相EIA：又称酶检测免疫分析技术（enzyme　monitored　immunoassay technique，EMIA）。酶与半抗原结合为酶标半抗原，与被测半抗原竞争地与抗体结合，标记抗原与抗体结合后，酶的活性即被抑制，因此不需加入分离剂，直接测定游离酶标半抗原的酶活性即可推算被测半抗原的量。EMIA主要用于小分子抗原或半抗原的定量，如激素、药物或毒品等的分析。

（2）异相EIA：酶标抗原或抗体与标本中的待检抗体或抗原结合，分离除去未结合酶标抗原或抗体后，加入酶底物显色即可做定性或定量分析。常用固相分离法，又称为酶联免疫吸附分析（enzyme　linked　immunosorbent　assay，ELISA），与均相EIA相比，该法应用范围较广，可标记各种抗原和抗体。

2．根据所用固相物质不同

（1）板式ELISA：全部反应和比色都在塑料微孔板中进行。目前国际通用8× 12的96孔板。

（2）管式ELISA：用小管作为反应容器和比色管，反应体积大，比色光径长，可在一定程度上提高检测灵敏度。

（3）小珠：一般直径为6mm，吸附面积明显增大。

3．按抗原抗体结合方式

（1）竞争性结合酶免疫法：标记抗原与待测抗原竞争地与抗体相结合。

（2）非竞争性结合酶免疫法：抗原抗体之间的反应不存在竞争性。现以应用最为广泛的ELISA为例加以说明。

①直接ELISA：酶标记抗体与待测抗原非竞争性结合，再与固相载体形成复合物，称双抗体夹心法，常用于测定较大分子抗原。

②间接ELISA：酶标记的第二抗体作为一种通用试剂，可与任何第一抗体结合。

【试剂组成】

1．酶标抗体（抗原）　要求酶稳定不失活，4℃可保存数月。

2．固相抗体（抗原）　聚苯乙烯微孔条，透明度高，吸附性能好，材质均匀，孔间差异小。包被抗原纯度高，包被抗体效价高，亲和力强，4℃、密封、避光、干燥的环境中保存，一般可保存6个月。

3．底物　底物应稳定，易于保存。OPD为白色粉末，易于氧化并对光敏感，应密封保存于棕色瓶内，4℃干燥环境下存放，临用前配制。而TMB配制后密封保存在棕色瓶内，4℃可存放半年。

4．结合物和标本的稀释液　稀释液中常加入高浓度的无干扰作用的蛋白质（如10g／L　BSA或5　0g／L脱脂奶粉），一般还含有0．05%非离子表面活性剂如Tween20，可抑制蛋白质在塑料表面的非特异性吸附。

5．洗涤液　常用含0．05%Tween20的PBS。

6．酶反应终止液　常用2mol／L硫酸。

7．校正试剂　参见时间分辨荧光免疫分析。

8．质控血清　参见放射免疫部分。

【检测条件】

1．仪器设备　专用微量加样器、加样头、平板震荡器、水浴箱或孵箱、洗板机、酶标仪。全自动酶联免疫分析系统，可精确控制反应条件，结果更为可靠。

2．样品采集、处理和储存　见放射免疫部分。

【检测方法】　以CanAg公司NSE检测试剂盒为例，其免疫反应原理为生物素－链霉亲和素参与的双抗体夹心法（生物素－链霉亲和素系统原理参见电化学发光部分），具体检测程序如下：

（1）将25μl样品或标准品按顺序加入链霉亲和素包被的微孔条中。

（2）每孔加入100μl单抗工作液（含HRP标记抗NSE单抗和生物素标记抗NSE单抗），形成生物素－抗体－抗原－抗体－HRP免疫复合物，并通过生物素－链霉亲和素的特异性结合固定于微孔内壁。

（3）室温孵育1h。

（4）洗涤微孔条并在滤纸上拍打除去残留洗涤液，重复6次，以去除游离的或抗体。

（5）加底物应用液（包含TMB和H2O2）。震荡反应30min。

（6）加终止液，混匀后在酶标仪上读取OD值，按要求作数据处理，得出结果。

【资料保存及报告要求】　参见时间分辨荧光免疫分析。

【质量控制】　见放射免疫部分。

【注意事项】

1．HRP　对金属污染物很敏感（甚至不能使用金属的加样器），因此对试剂和试验用水的要求较高，应用新鲜的蒸馏水或去离子水。但通过聚苯乙烯树脂得到的无离子水常影响HRP活力，如果不使用Tween20，作固相载体用的聚苯乙烯板也可影响HRP活力。另外，HRP对细菌及抑菌剂如NaN3特别敏感，因此用NaN3防腐的标本不可用于HRP标记的一步法ELISA；试验用水中的氧、次氯酸、芳香族的氯碳化合物都会影响HRP的活力。此外应注意H2O2不仅是HRP的底物，也是HRP的抑制剂，过量的H2O2对固相HRP的抑制作用比游离HRP更明显，因此HRP的浓度应维持在0．01%～0．03%。同时，H2O2易挥发，放置过久引起浓度降低，可使OD值降低。

2．OPD　可能有致癌作用，故目前倾向用TMB代替OPD。

3．AP来源　牛的肠黏膜和大肠杆菌，二者的最佳酶活度的pH值不同，前者为pH　10，后者为pH　8。无机磷酸盐是AP的强抑制剂，因此试验中应避免使用PBS液；金属络合剂如EDTA也是AP的强抑制剂，应注意避免。

4．孵育　最好在水浴中进行，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡，各板不可重叠，板上应加盖防止蒸发。如在孵育箱中反应，应将板置于湿盒中。