酶增强发光免疫分析

【原理】　ECLEA是将化学发光物质作为酶的发光底物，由酶触发化学发光物质激发过程，产生光子。通过酶标抗原或抗体间的竞争性或非竞争性免疫结合反应，形成酶标复合物，再加化学发光底物，经酶促反应发光。其发光持续时间可长达30min以上，同时发光强度也大为提高，改善了信噪比，提高了灵敏度。目前常用的ECLEA系统有2种：

1．辣根过氧化物酶－H2O2－鲁米诺－增强剂系统　在此系统中辣根过氧化物酶（HRP）可使H2O2产生新生O2作用于鲁米诺，形成激发态中间体，并分解发光，经增强剂（如对位碘酚、对位苯基酚）作用，可使发光时间延续30min以上，信号强度增加1　000倍以上。该系统已开发成熟的商业性试剂如Amerlite系统。

2．碱性磷酸酶－环1，2－二氧乙烷衍生物系统　常用的发光底物为金刚烷基1， 2－二氧乙烷磷酸盐以及3－（2－螺旋金刚烷）－4－甲氧基－4－（3－磷酸氧基）－苯基－1，2－环二氧乙烷，简称AMPPD。AMPPD经酶解去除芳香基团上的一个磷酸基，得到中等“稳定”的中间体AMPPD—（半衰期2～30min），并进一步裂解为金刚烷酮和激发态的间氧苯甲酯阴离子，当其跃迁回到基态时产生光子（波长470nm）。AMPPD在碱性和热环境下稳定性好，故本底低，pH　7．0时，室温下分解半衰期长，pH 9．5时酶解速度快，发光持续15～60min，光强度稳定，在0．1%BSA的反应液中发光强度明显增强。

现以DPC公司的仪器为例加以说明。

【试剂盒】

1．校正试剂　参见时间分辨荧光免疫分析。

2．碱性磷酸酶（AP）标记抗体或抗原　要求标记物稳定不失活。4℃可保存数月。

3．Test　unit　为盛有抗体包被小珠的测试杯，兼作离心管用，在1万r／s的离心作用下清洗包被珠并将洗涤液排出到测试杯的外圈夹层中，为公司的专利。

4．发光底物

【检测步骤】　全部试验过程均在IMMULITE全自动化学发光免疫检测系统上按预设程序自动完成，用时约50min（一步法）或80min（二步法）。以一步法为例，检测步骤如下：

（1）依次在Test　unit中加入待测标本或校正试剂＋AP标记的抗原或抗体。

（2）37℃温育30～60min。

（3）高速离心除去未结合抗原或抗体。

（4）离心洗涤3次。

（5）加入发光底物，反应10min。

（6）光量子检测系统读取发光强度并经数据处理计算待测物质浓度。

【资料保存及报告要求】　参见时间分辨荧光免疫分析。

【质量控制】　见放射免疫部分。

【注意事项】

（1）应严格按照仪器说明书要求做好维护保养工作，保持管路清洁畅通。

（2）系统对运行环境要求较高，应严格控制室内温度和湿度。

（3）所有定标液、质控液、标本和test　unit在操作前必须在20～25℃，试剂和标本应充分混匀。