污染物生物毒性的微生物检测

三、污染物生物毒性的微生物检测——发光细菌的微毒检测法

微生物对环境条件的变化十分敏感，与毒性试验常用的传统材料——哺乳动物相比，材料容易取得，操作快速简便、成本低廉，故在实践中常用于检测污染物的生物毒性。一般是选择微生物的某一项和数项生理指标(如细胞生长、呼吸、酶活性等)，根据待测物质的影响或抑制程度来判断毒性的强度，常用EC₅₀(50%effective concentration，半数有效浓度)、IC₅₀(50%inhibition concentration，半数抑制浓度)表示，所用的微生物有细菌、藻类、原生动物，既有纯培养也有混合菌株甚至是群落级的。如硝化细菌的硝化作用抑制试验(nitrification inhibition test)、藻类生长抑制试验(algal growth inhibition test)、发光细菌发光抑制试验、活性污泥脱氢酶活性试验(dehydrogenase activity test)、微型生物群落毒性试验(microbial community toxicity test)等，其中又以发光细菌检测法最具优势，得到广泛应用。

发光菌检测法一般是以一种非致病的明亮发光杆菌作指示物，以其发光强度的变化为指标，测定环境中有害有毒物质的生物毒性的一种方法。发光细菌法是2 0世纪70年代后期提出的一种微生物监测环境水质毒性的新方法，其可与鱼类96h急性毒性试验相媲美。该方法具有快速、简便、灵敏度高、费用低廉等优点。

发光细菌属革兰氏阴性、兼性厌氧菌，无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根，大小约0.4×1.0～1.0～2.5μm。最适温度20～30℃，pH6～9。发光细菌发光是菌体生理代谢正常的一种表现，这类菌在生长的对数期间发光能力很强。当环境条件不良或有毒物存在时，其发光能力会减弱，减弱的程度同毒物毒性大小和浓度有一定的比例关系。通过灵敏的光电测定装置，检查在毒物作用下发光细菌的发光强度变化可以评价待测物的毒性。

自1672年R.Boyle观察到发光的细菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科学家相继对发光细菌进行了大量的研究。20世纪70年代至80年代初，国外科学家首次从海鱼体内分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测生物毒性。

20世纪80年代初我国引进了这项技术，并先后分离出海水型和淡水型的发光细菌，用以检测环境污染物的急性生物毒性;近年来还分离出明亮发光杆菌变种用以检测环境污染物的致突变性，从而扩大了检测范围。

目前，发光细菌检测法已成为一种常用的简单、快速的生物毒性检测手段。

当发光细菌接触到环境中有毒污染物时，可影响或干扰细菌的正常新陈代谢活动，因此其发光强度即发生改变，且其变化的大小与受试物的浓度相关，同时与该物质的毒性大小有关。

1.基本原理

细菌的发光过程是菌体内一种新陈代谢的生理过程，是光呼吸过程，即菌体借助活体细胞内的ATP、荧光素(FMN)和荧光素酶发光。其综合化学反应过程为:

该光波长在490nm左右。发光细菌是兼性厌氧菌，在有氧存在下才发光，发光细菌对氧的灵敏度高，对毒气(如SO₂)、毒药、麻醉剂、氰化物等抑制剂也异常敏感。这种发光过程极易受到外界条件的影响。凡是干扰或损害细菌呼吸或生理过程的任何因素都能使细菌发光强度发生变化。当有毒有害物质与发光菌接触时，发光强度立即改变，并随着毒物浓度的增加而发光减弱。

一般认为外来受试物通过两个途径抑制细菌发光:直接抑制参与发光反应的酶类活性;抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。

这种发光强度的变化可以用精密测光仪器定量地进行测定。发光菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光菌发光强度的影响。毒物的毒性可以用EC₅₀表示，即发光菌发光强度降低50%时毒物的浓度。实验结果显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小，用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。

发光菌毒性检测通常采用的是一种海洋发光菌(Photobacteri-umphosphoreum sp.T3)。但是，在利用海洋发光菌进行环境样品毒性测试时，测试体系中须加入较高浓度的盐以维持其正常生存，然而，大量氯离子的存在会在相当程度上影响样品中一些污染物的生物可利用性和毒性顺序。1985年我国学者从青海黄鱼体表分离出一种淡水型发光菌(Vibrio qinghaiensis)，它具有较广泛的酸碱和温度适应性，并可在蒸馏水中正常发光，使测试体系得到简化。另外还分离出了明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)。目前应用较多的是明亮发光杆菌和鲾鱼发光杆菌。

美国Backman公司在1978年研制成一种生物发光光度计(或称生物毒性测定仪)商标名称“Microtox”，所用菌剂是明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)。因其快速、简便、费用低廉而独具特色。从此，发光细菌毒性测试(luminescent bacteria toxicitytest，LBT)技术备受重视，并以检测时间短，灵敏度高而被世界各国广泛采用。我国于1995年也将这一方法列为水质急性毒性的检验标准方法(GB/T15441-1995)。

2.测定方法

目前国内外细菌发光的测定常用的有两种方法。

①新鲜发光细菌培养测定法。即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条件下(20±0.5℃)振荡液培养到对数生长期，配置为含有3%NaCl盐度的适当浓度的菌悬液加入测定管中，再加入待测液，使之和菌种接触，作用5～15min后，记录对照和样品管的发光强度。此法操作较为简便。

②冷冻干燥发光细菌制剂测定法。将培养到对数生长期的发光细菌，以冷冻干燥法制成冻干粉剂，使用时加入冷的2%NaCl溶液复苏，使其恢复到原来的生理状态和发光水平，然后用于测定。这是国家标准方法，其优点是可实行测定的质量控制。冻干粉可长期保藏，方便使用，操作简便，节约时间。

细菌发光监测技术在水质监测中已得到广泛的应用。LBT技术自出现以来就有十分迅速的发展。由于其独特的优点，世界各国正逐步将其列为环境监测的标准方法。

明亮发光杆菌是水中低浓度有机毒物的有效指示生物。并且发光细菌毒性试验是一种快速、简便的毒性测试方法，其结果与鱼类毒性试验可以互相替代。此外，LBT技术除了应用于上述各类污染物的急性毒性分析外，对发光细菌进行特殊处理后，LBT技术还发展了检测污染物遗传毒性的功能。基本原理是发光细菌经过各种理化方法诱变处理后失去发光的能力，称为暗变异株。而一旦接触到致突变物后，暗变异株可恢复一定强度的发光能力(通常可使暗变异株的发光强度增加1000倍左右)。利用这种恢复发光的现象，可以对各种遗传毒物进行筛选、检测，与其他微生物学方法(如Ames试验)相比有灵敏、简便、快速、无须严格无菌操作等优点。现已将发光细菌法用于监测环境中生物毒性物质、抗生素的效价、血清的杀菌活性等方面。利用发光细菌的暗突变菌株来测定环境中诱变物质和致癌物质等。

研究表明在由特殊成分组成的培养液中，发光细菌的发光强度可在相当长时间内(24h)保持相对稳定，在此期间内细菌细胞已增殖一代以上，因此可用于污染物的慢性毒性分析，这种方法很好地区分了苯酚和铬离子的急性毒性和慢性毒性。因此可以将LBT技术发展成为可同时分析污染物急性毒性、慢性毒性和遗传毒性的多功能检测手段。

LBT技术与其他生物测试手段及化学分析方法结合起来，如将LBT技术与Ames致突变试验、色谱/质谱分析方法结合起来，可对污染物的各类毒性进行全面评价。

另外，将LBT技术与新的光电子技术(如光纤技术、传感器技术)相结合也是将来的发展方向之一。使之逐步成为在线监测系统，为水质分析提供更加快速的测试手段。

总之，LBT技术自出现以来就有十分迅速的发展。由于其独特的优点，世界各国正逐步将其列为环境监测的标准方法。