致突变污染物的微生物检测

二、致突变污染物的微生物检测

污染物对人体的潜在危害，已引起人们的普遍关注。世界上已经发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。环境污染的遗传学效应主要表现在污染物的致突变效应，致突变作用是致癌和致畸的根本原因。具有致突变效应的化合物数量巨大，这就需要快速的检测方法。微生物生长快的特点正好符合这种要求，微生物检测被公认是致突变物初步检测的最好方法。

自20世纪70年代以来，已建立了多种利用微生物作为测试材料试验污染物致突变性的方法。如利用营养缺陷型菌株回复突变试验、正向突变试验、发光细菌暗突变株恢复发光试验、DNA损伤修复试验以及DNA重组试验等，检测污染物的遗传毒性，涉及的微生物如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等细菌，粗糙脉孢菌、构巢曲霉、酿酒酵母等真菌。

目前最常用的是美国Ames教授等于1975年正式发表的检测DNA碱基序列是否发生改变的致突变试验——鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(简称Ames试验)。该沙门氏菌回复突变试验因快速、简便、灵敏、经济，且适用于测试混合物，能反映多种污染物的综合效应，被各国广为采用。众多学者有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加安全卫生的消毒措施;或检测城市污水和工业废水的致突变性，综合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据;有的用该法研究化合物结构与致突变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据;还有的用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等。

1.Ames试验的试验原理

Ames试验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型菌株(his^－)在致突变物的作用下发生回复突变的性能来检测物质的致突变性。常用的组氨酸营养缺陷型(his^－)菌株有五种，都含有控制组氨酸合成的基因。当培养基中不含有组氨酸时只有极少数的细胞可以发生自发回复突变作用，形成在显微镜下才可以观察到的微菌落。但是当受到某种致突变物质的作用时，菌体内的DNA会受到损害，大量细胞发生回复突变，在特定部位会发生基因突变而回复为野生菌型，自行合成组氨酸，在这样的情况下，培养基中没有组氨酸该菌种也能生长，形成肉眼就可以看见的菌落。

某些化学物质需经代谢活化才有致突变作用，为使测试条件更加近似于人体内的代谢条件，这就需要在测试中加入哺乳动物微粒体酶(简称S-9混合液)，可以弥补体外实验缺乏代谢活化系统的不足。因而Ames实验也叫鼠伤寒沙门氏/哺乳动物微粒体实验法(Salmonella typhimurium/mammalian microsome test)。S-9混合液通常用大鼠肝匀浆、NADP、G-6-P、MgCl₂、KCl、KH₂PO₄和水等配制成。

用于测试的菌株需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求的才可以使用。目前一般使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前要进行增菌培养。

2.Ames试验的试验方法

Ames试验有纸片点试和平皿掺入试验两种方法。

(1)纸片点试

吸取0.1ml增菌培养后的测试菌，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需要S-9活化的再加入0.3～0.4ml的S-9混合液，立即混匀铺平于平板底上，冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿溶液，或直接取固态受实物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶液对照和阳性对照，分别贴于平板上相应位置。平皿倒置于37℃培养箱中培养48小时。在纸片外围张出密集菌落圈的为阳性;菌落散布，密度和自发回变相似的为阴性。斑点实验只局限于可以在琼脂上扩散的物质，大多数环芳香烃和难溶于水的化学物质不适宜该方法。而且该方法的敏感性差，主要作为一种定性实验，适用于快速筛选大量的待测化合物。

(2)平皿掺入试验

基本与上法相似，只是不加纸片，在表层培养基中除菌液和S-9混合液外，还加入0.1ml一定浓度的待测液，然后进行培养。近年来提出了一种改良的方法。是将上述菌液、待测液和S-9混合液预先在37℃水浴锅中温育20分钟，然后再混入表层培养基中倒皿。这种方法可以检验出Ames原法中不能够检出的某些物质，如二甲亚硝胺类。平板试验可定量测试样品致突变性的强弱。此法比纸片点试法敏感。

鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故Ames试验现广泛应用于致癌物的筛选。