化学发光免疫分析技术

二、化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是将化学发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种用于检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。根据其标记物及反应原理的不同可分为直接化学发光免疫分析技术、化学发光酶免疫分析技术（luminescence enzyme immunoassay，CLEIA）和电化学发光免疫分析技术（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）三种类型。

（一）化学发光与化学发光剂

1.发光　分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再回复到基态，并释放光子的过程。

2.化学发光　是指伴随化学反应过程产生光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。

3.化学发光剂　化学发光剂是指在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，又称为发光底物。常用的化学发光剂有：

（1）直接化学发光剂　直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体，目前常用的是吖啶酯。

（2）酶促反应发光剂　酶促反应发光剂是利用标记酶的催化作用，使发光剂发光，目前常用的标记酶有HRP和AP，前者催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物，后者的为1，2-二氧环己烷衍生物（AMPPD）。

（3）电化学发光剂　指通过在电极表面进行电化学反应而发光的物质。三联吡啶钌是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。

4.化学发光剂标记物的制备　化学发光剂标记物是指将化学发光剂与抗体或者抗原结合在一起的复合物。它的标记方法很多，大多数是利用交联剂使化学发光剂与被标记物分子结构中的游离的氨基、羧基、硫氢基、羟基等基团形成不可逆的连接。

（二）化学发光免疫分析技术的类型

1.直接化学发光免疫分析技术

（1）原理　直接化学发光免疫分析技术的基本原理是用化学发光剂（常用吖啶酯）直接标记抗原或抗体与待测的抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场将化学发光剂标记物的结合状态（B）和游离状态（F）分离出来，然后在结合状态（B）部分中加入发光促进剂进行反应，最后通过测定结合状态（B）的发光强度进行定性或定量分析。

（2）技术要点　直接化学发光免疫分析技术的要点主要包括三个部分。①抗原抗体反应：抗原抗体反应的类型有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种类型，现以双抗体夹心法为例，将包被单克隆抗体的磁性颗粒和待测标本加入反应管中，结合后，加入吖啶酯标记的抗体，经过温育，形成颗粒型抗体—待测抗原—吖啶酯标记抗体复合物。②分离结合状态（B）和游离状态（F）酶标记物：用磁颗粒分离技术，通过2～3次洗涤，快速洗去未结合的抗原和多余的标记抗体，留下颗粒型抗体—待测抗原—吖啶酯标记抗体复合物。③化学发光反应：在洗涤后的磁性颗粒中加入NaOH纠正液使其呈碱性，然后加入H₂O₂，这时吖啶酯在没有催化剂的情况下也能够分解发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大，记录1s内产生的电子能，这部分光的积分与待测抗原的含量呈正相关，根据标准曲线，可计算出待测抗原的含量。

2.化学发光酶免疫分析技术　属于酶免疫测定的一种，只是最后一步酶反应所用的底物为发光剂，通过光强度的测定而直接进行定量分析。

（1）原理　CLEIA是用参与催化某一化学发光反应的酶如HRP或AP来标记抗体（抗原），在与待测标本中相应的抗原（或抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入发光剂，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。

（2）技术要点　化学发光酶免疫分析技术的技术要点主要包括三个部分。①抗原抗体反应：抗原抗体反应的类型也有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种类型，现以双抗体夹心法为例，将包被单克隆抗体的磁性颗粒和待测标本加入反应管中，结合后，加入HRP标记的抗体，经过温育，形成磁性颗粒抗体—待测抗原—标记抗体复合物。②分离结合状态（B）和游离状态（F）酶标记物：用磁颗粒分离技术，洗涤2～3次，去除未结合的抗原和多余的标记抗体，留下颗粒型抗体—待测抗原—HRP标记抗体复合物。③化学发光反应：在洗涤后的磁性颗粒中加入用0.1 mol/L的pH8.6 Tris缓冲液稀释的鲁米娜、H₂O₂和发光增强剂（如邻-碘酚），用特定仪器测定光强度而进行定量检测（图6-22）。

图6-22　辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意

3.电化学发光免疫分析技术

（1）原理　ECLIA是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移可发生特异性化学发光反应（图6-23）。

（2）技术要点　ECLIA的技术要点主要包括三个部分。①抗原抗体反应：抗原抗体反应的类型有双抗体夹心法、双抗原夹心法和固相抗原竞争法三种类型，现以双抗体夹心法为例，三联吡啶钌标记抗体和生物素标记的抗体与待测标本一起加入反应杯中进行孵育，然后加入链霉亲和素包被的磁珠，再次孵育，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、抗体连为一体，形成双抗体夹心物。②结合状态（B）和游离状态（F）的分离：用磁颗粒分离技术，将形成的双抗体夹心物吸进流动测量室，同时，游离的标记抗体被吸出测量室。③电化学发光反应及检测：ECLIA反应过程中在电极表面周而复始地进行，产生大量光子，利用光电倍增管检测光强度，光强度与三联吡啶钌的浓度呈线性关系，根据标准曲线算出待测抗原的含量。

图6-23　电化学发光免疫分析技术示意

（三）化学发光免疫分析技术的临床应用

化学发光免疫分析技术无放射性污染、快速、准确、特异，而且实现了自动化，因此日益受到人们的重视，已经成为一种先进的微量生物活性物质的检测技术，如激素、肿瘤与病毒标志物、药物浓度以及贫血因子等的测定。