肾活检标本免疫化学及免疫荧光染色的制备技术

【免疫化学染色试剂】

1.pH7.4　0.01mol／L磷酸盐缓冲液（PBS）（用于稀释抗体，冲洗切片）

A液0.2mol／L Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O　35.82g／500ml蒸馏水

B液0.2mol／L Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O　15.6g／500ml蒸馏水

A液40.5ml，B液9.5ml，加8.8g NaCl，蒸馏水（DW）稀释至1　000ml

2.pH7.2　0.15mol／L PBS缓冲液（洗液）

Na2HPO4·12H2O　96.695g

KH2PO47.145g

NaCl　10.625g

蒸馏水溶解至5　000ml

3.pH　7.6　0.05mol／L Tris-HCl缓冲液

0.2mol／L Tris：称取三羟甲基氨基甲烷24.3g，加DW溶液至1　000ml

0.1mol／L HCl：浓HCl　8.8ml加水至1　000ml

0.1mol／L HCl　389ml，加入0.2mol／L Tril　250ml，再加DW至1　000ml

4.3.3′二氨基联苯胺（DAB）-H2O2显色液

3mg DAB加5ml pH7.6　0.05mol／L Tril-HCl缓冲液溶液，加8μl　3%H2O2，充分混匀，临用前配制。

5.苏木素染液

苏木素　　　　　　　1g

无水乙醇　　　　　　10ml

钾明矾（硫酸铝钾）　20g

蒸馏水　　　　　　　200ml

氧化汞　　　　　　　1g

冰醋酸　　　　　　　12ml

甘油　　　　　　　　10ml／500ml

配制时先将明矾溶解，再将苏木素溶于乙醇倾入明矾液中，混匀后用火煮沸，加入氧化汞1g，以玻璃棒搅至深紫色立即移入冷水，静置过夜，过滤，加入甘油密封保存，用时加入冰醋酸。

【肾组织免疫荧光染色（直接法）】

1.肾组织冰冻切片吹干。

2.加适当稀释度抗体异硫氰荧光素（FITC）（IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q），置湿盒室温40min。

3.取出后流水冲洗，吹干。

4.荧光显微镜下镜检。

5.若需照相，用50%缓冲甘油（0.5mol／L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）封固。

【肾组织免疫酶标染色】

1.冰冻切片直接免疫酶标染色法

（1）3μm冰冻切片未经固定，电风扇吹干。

（2）加适当稀释度辣根过氧化酶（HRP）-抗体（IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q、HBS）置湿盒37℃40min。

（3）取出后流水冲洗，pH7.2　0.15mol／L PBS洗3次，吹干。

（4）浸入（或滴加）DAB-H2O2显色5min，水洗。

（5）苏木素复染，水洗吹干后封片镜检。

2.冰冻切片过氧化酶-抗过氧化酶复合物（PAP）四层法

（1）充分吹干切片，冷丙酮固定10min，吹干。

（2）10%小牛血清室温作用20min。

（3）去除多余液体，加工作浓度单克隆抗体室温孵育1.5h。

（4）pH　7.4　0.04mol／L PBS充分冲洗。

（5）加HRP-RAM　1∶100抗体，室温40min［稀释液同（5）］。

（6）洗片同（4）。

（7）加1∶50兔PAP室温40min。

（8）洗片同（4）。

（9）加DAB-H2O2显色液，镜下观察控制显色时间，流水洗去显色液，苏木素复染细胞核，水洗。

（10）吹干，树胶封片。

3.结果判断

（1）肾小球：观察并记录肾活检切片中所有肾小球中阳性细胞总数，再以此总数除以每份切片中肾小球个数，得出每个肾小球内阳性细胞相对平均值，同时分别记录球内阳性细胞最高值、最低值。

（2）肾间质：15倍目镜中加25格测微器，在40倍镜下，参照血细胞计数板算得每平方毫米内阳性细胞数。

（3）肾小管：分别计数皮、髓质各50个肾小管，分别乘以2再求其百分数。

【石蜡切片免疫组化】

1.标本处理

（1）标本固定（升汞－苦味酸固定液）

A液：饱和氯化汞　4.5ml

甲醛　0.5ml（临用时混合）

B液：苦味酸饱和溶液

组织取好后，先放入A液中5min，再将组织转入B液2.5ml中5h至过夜。

（2）脱水

①75%乙醇10min洗苦味酸。

②90%伊红乙醇10～15min。

③95%乙醇10～15min。

④将组织块用擦镜纸包好，放入无水乙醇（优级醇）10min×2，中间摇动数次。

（3）透明：将组织块放入氯仿中10min×2，10min后更换氯仿。

（4）浸蜡：将透明过的组织投入蜡Ⅰ（60℃，不含松香）20～30min，再移至蜡Ⅱ（60℃，含少许松香）1～1.5h。

（5）包埋、切片：将浸过蜡的组织包埋成蜡块，切片时将蜡块冻入液氮罐中1min，取出，切片1μm厚，蜡片漂浮于35℃水中，贴片后62℃烤片5min，冷却待用。

2.石蜡切片PAP四层法染色

（1）将石蜡切片脱蜡入水，先入二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸，各10min，再入无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各10min，将切片浸入水中。

（2）如需要0.05%胰蛋白酶消化5min，水洗。

（3）PBS洗片。

（4）10%FCS室温20min。

（5）加工作浓度的特异性单克隆抗体室温过夜。

（6）余后处理完全同冰冻切片染色法。