免疫酶组织化学技术

（一）概述

免疫酶组织化学法是免疫组织化学中最常用的方法之一，它以抗原抗体反应为前提，借助酶组织化学，检测细胞或组织内特异抗原。免疫酶法与免疫荧光法相比较，酶反应产物呈现的颜色能在普通显微镜下观察，也可以用电镜观察；制片能够长期保存。

【基本原理】　与免疫荧光法相似，不同的是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性抗原抗体复合物。

【主要特点】　用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体进行免疫酶法染色，但实际上能用于免疫组织化学技术的酶并不多。

【标记条件】　Sternberger等指出，用于标记的酶应具备以下条件。

（1）酶催化的底物必须是特异的，而且催化反应所形成的产物能在光镜和电镜下观察。

（2）酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定，不能向周围组织弥散，影响组织定位。

（3）酶应较易提纯。

（4）中性pH时，酶分子应稳定。

（5）在酶标过程中，酶连接在抗体上，不能影响两者的活性。

（6）被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶。

【常用酶】　符合上述要求的，最为常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish　peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkaline　phosphatase，ALP）、葡萄糖氧化酶（glucose　oxidase，GOD）。

1．HRP　是一种含铁血红素的植物过氧化物酶，广泛分布于植物界，因其在植物辣根中含量高而得名。它是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，分子量为40ku，等电点3～9，最适pH为5．0左右。HRP易溶于水，其活性部分为铁卟啉，称辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。酶的蛋白部分无活性。酶蛋白和铁卟啉辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm；HRP的纯度用两者的光密度比值来衡量，以RZ（Reinheit　Zahl）来表示。一般认为，标记酶的RZ值为3．0左右，不应＜2．8，RZ值越小，酶的纯度越差。对于纯度低、质量差的酶，需经纯化后才能使用。

2．ALP　是一种磷酸水解酶，目前已发现有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5与ALP6六种同工酶。在多种组织和细胞中有分布，如肝脏、肾脏、骨骼、肠和胎盘等，其中以肝组织中含量最高。ALP的分子量为80ku，最适pH为9．8，其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等因素影响。ALP的活化剂有镁离子和锰离子。抑制药有甘氨酸、柠檬酸盐、EDTA等。ALP对温度具有较高的敏感性，从25℃增加到35℃，其催化反应速度增加1．5倍。当选用不同的底物时，ALP可催化形成不同颜色的终产物。目前常用的ALP大多来自于牛的肠黏膜，近年ALP标记的抗体得到广泛的应用，在染色中有一主要问题是内源性ALP的广泛存在。在免疫组化染色中，最常用的方法是在底物液中加入左旋咪唑，能有效去除大部分内源性ALP。

3．GOD　是一种典型的氧化还原酶，所催化的底物为葡萄糖，分子量约160ku，由2个或4个多肽链构成，酶反应的最适pH　5～7，最适温度是30～40℃，终产物稳定，为不溶性的蓝色沉淀。哺乳动物组织内不存在内源性葡萄糖氧化酶，能够很好地避免内源性酶的干扰，因此，从理论上讲，GOD应比ALP和HRP更好。但是，GOD的分子较HRP大3倍，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，限制了其更广泛的使用。

（二）常用免疫酶法

★直接法

【基本原理】　将酶直接标记在特异性抗体上，然后直接与相应抗原特异地结合，形成抗原－抗体－酶复合物，再与酶的底物作用产生能在光镜下直接观察的有色的产物，沉积在抗原抗体反应的部位，可对抗原进行定性、定位以至定量研究。

【主要特点】　直接法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低，缺点是每种抗原必须分别用其酶标记的抗体，且敏感性较间接法低。

【染色步骤】

（1）石蜡组织切片常规脱蜡、梯度乙醇入水。

（2）0．3%H2O2－甲醇液封闭，10～15min，室温。冷冻切片、细胞涂片从此步骤开始。

（3）水洗后PBS洗3次，每次5min。

（4）胰酶或胃蛋白酶消化进行抗原修复，37℃，10～30min。

（5）PBS洗2次，每次5min。

（6）正常血清孵育，封闭非特异性结合位点，室温，15min。

（7）甩掉切片上的血清不漂洗，加酶标记抗体，37℃，30min，置湿盒内。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）加酶底物显色。显微镜下观察控制呈色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。

（10）自来水充分冲洗。

（11）苏木素复染胞核，盐酸乙醇分化，氨水返蓝。

（12）梯度乙醇脱水、透明、封片。

★间接法

【基本原理】　先将未标记的特异性抗体（一抗）与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用二抗（酶标抗体）与复合物中的特异抗体结合，形成抗原－抗体－酶标抗体复合物，最后与酶的底物作用产生能在光镜下直接观察的有色产物。

【主要特点】　选择一抗和二抗，必须保证两者能发生连接，如一抗是由大鼠产生的，则二抗必须是酶标记的抗大鼠的免疫球蛋白，例如兔抗大鼠、羊抗大鼠。如果选择的二抗为羊抗兔，将不能正常反应。间接法的优点是用一种酶标抗体，可以应用于多种一抗，而且敏感性也优于直接法。

【染色步骤】

（1）～（6）同“直接法”。

（7）甩掉正常血清，滴加适当稀释度的一抗，37℃，30～60min或4℃过夜，置湿盒中。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）滴加适当稀释的酶标二抗，37℃，30min。

（10）PBS洗3次，每次5min。

（11）加酶底物显色。显微镜下观察控制呈色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。

（12）自来水充分冲洗。

（13）苏木素复染或不复染。

（14）梯度乙醇脱水、透明、封片。

★酶桥法

【基本原理】　用酶免疫动物，制备高效价、特异性强的抗酶抗体，用二抗作桥，将抗酶抗体和特异性的第一抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，形成酶－抗酶抗体－桥接二抗－特异抗体（一抗）复合物，最后经过酶催化底物形成光镜下可直接观察的有色的产物，标记出抗原的位置、含量。

【主要特点】　酶桥法是对免疫酶法的重大改进，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合的，避免了间接法中共价连接对酶活性的影响，提高了方法的敏感性。酶桥法虽然克服酶标记抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶的活性，也提高了敏感性，实际运用中，游离酶的浓度难以准确把握，而且由于组织中非特异性结合的酶难以去除，导致背景着色较重。

【染色步骤】

（1）～（6）同“直接法”。

（7）甩掉正常血清，滴加适当稀释度的一抗，37℃，30～60min或4℃过夜，置湿盒中。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）加二抗，37℃，30min。

（10）PBS洗3次，每次5min。

（11）加抗酶抗体（三抗），37℃，30min，置湿盒中。

（12）PBS洗3次，每次5min。

（13）加酶溶液，37℃，30min，置湿盒中。

（14）PBS洗3次，每次5min。

（15）加酶底物显色。显微镜下观察控制呈色反应，以结果清晰，背景无非特异性染色为度。

（16）自来水充分冲洗。

（17）苏木素复染胞核或不复染。

（18）梯度乙醇脱水、透明、封片。

★PAP法

【基本原理】　PAP法是酶桥法等基础之上建立的，基本原理与酶桥法相似。

【主要特点】　最大改进是将酶和抗酶抗体制成复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，将这两步合并为一步。这一改进，不仅仅是简化步骤，而且最大限度地保存了抗体和酶的活性，优化了两者的比例，提高了灵敏度，解决了酶桥法中酶标记的非特异性抗体与组织抗原结合，引起背景染色的问题，背景着色淡。

【染色步骤】

（1）～（6）同直接法。

（7）甩掉正常血清，滴加适当稀释度的一抗，37℃1h或4℃过夜，置湿盒中。

（8）PBS洗3次，每次5min。

（9）加二抗（桥抗体，无生物素标记），室温或37℃，0．5～1h。

（10）PBS洗3次，每次5min。

（11）加PAP复合物（即酶－抗酶抗体复合物），37℃，0．5～1h。

（12）PBS洗3次，每次5min。

棬棻棾棭滴加棸灡棸椀棩斈斄斅灢棸灡棸棻棩斎棽斚棽棬棸灡棸椀旐旓旍棷斕棳旔斎椃灡棿的斣斅斢配制棭棳室温显色棻棸暙棽棸旐旈旑棳显微镜下观察控制呈色反应棳以结果清晰棳背景无非特异性染色为度暎棬棻棿棭自来水洗终止反应暎棬棻椀棭梯度乙醇脱水暍透明暍封片暎曪双斝斄斝法暰主要特点暱 双斝斄斝法棳又称双桥法棳是对斝斄斝法的改进棳通过两次连接桥抗体和斝斄斝棳在抗原抗体复合物上结合了比斝斄斝法更多的酶分子棳可提高敏感性达棽棸暙椀棸倍暎但双斝斄斝法步骤多暍需时长棳在实际操作中棳也可能会导致非特异性放大暎

染色步骤

棬棻棭暙棬棻棽棭步同暟斝斄斝法暠暎棬棻棾棭重复滴加二抗棳但稀释度是前次的棻倍棳棾椃曟棳棾棸旐旈旑棳置湿盒中暎棬棻棿棭斝斅斢洗棾次棳每次椀旐旈旑暎棬棻椀棭重复滴加斝斄斝复合物棳稀释度也是前次的一倍棳棾椃曟棳棾棸旐旈旑棳置湿盒中暎棬棻椂棭斝斅斢洗棾次棳每次椀旐旈旑暎棬棻椃棭加酶底物显色暎显微镜下观察控制呈色反应棳以结果清晰棳背景无非特异性染色为度暎

棬棻椄棭自来水充分冲洗暎

棬棻椆棭苏木素复染胞核暎

棬棽棸棭梯度乙醇脱水暍透明暍封片暎

曪碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法

暰主要特点暱 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶棬斸旍旊斸旍旈旑斿旔旇旓旙旔旇斸旚斸旙斿斸旑旚旈斸旍旊斸旍旈旑斿旔旇旓旙旔旇斸旚斸旙斿棳斄斝斄斄斝棭法是在斝斄斝法的基础上棳用斄斕斝替代斎斠斝进行酶底物催化棳它们都属于未标记抗体桥联法暎其主要优点椇栙敏感性好棳不受组织中内源性过氧化物酶的影响和干扰椈栚在血暍骨髓暍脱落细胞涂片染色效果更好椈栛反应稳定棳着色清楚棳背景淡暎而且斄斝斄斄斝法避免了使用有致癌嫌疑斈斄斅显色暎但本法用快红或快蓝显色棳只能用水性胶封片棳而且切片保存时间较短棳一般只有数月即会褪色暎

暰染色步骤暱

棬棻棭暙棬椄棭同暟斝斄斝法暠暎

棬椆棭加斄斕斝标记的二抗棳棾椃曟棳棾棸暙椂棸旐旈旑棳置湿盒中暎

棬棻棸棭斝斅斢洗棾次棳每次椀旐旈旑暎

棬棻棻棭加入斣斅斢棬内含棻旐旐旓旍棷斕左旋咪唑棳椀旐旐旓旍棷斕斖旂斆旍棽棭阻断内源性碱性磷酸酶暎

棬棻棽棭滴加适当稀释的斄斝斄斄斝复合物棳棾椃曟棳棾棸旐旈旑暎

棬棻棾棭斝斅斢洗棾次棳每次棾旐旈旑暎

棬棻棿棭滴加斄斕斝底物溶液棳棾椃曟棳棻椀暙棾棸旐旈旑棳阳性结果显现清晰后流水冲洗暎

棬棻椀棭复染暍常规冲洗暍甘油明胶封片暎

曪抗生物素灢生物素免疫组织化学染色法

生物素棳即维生素斎棳与卵白素之间有高度的亲和性棳是自然界中亲和力最强的物质之一暎人们最早注意到这一现象是发现在给动物饲以大量鸡蛋白后棳会引起暟维生素斎缺乏症暠暎

【基本原理】

生物素是一种小分子维生素，它与卵白素能相互牢固结合而不影响彼此生物活性，它们之间的亲和性是抗原抗体的100万倍。到了20世纪70年代，人们又发现生物素可以和抗体交联。

【主要特点】

1．亲和素－生物素法（avidin－biotin　complex，ABC）　1981年美籍华人许世明利用生物素和卵白素之间高度亲和的特点创建了亲和素－生物素法（avidin－biotin　complex，ABC），其特点是用卵白素分别连接生物素标记的二抗和生物素标记的酶，而且以过氧化物酶为桥，连接于卵白素之间，交联成网状，形成ABC复合物，极大地提高了敏感性，而且该方法特异性高、背景染色淡、方法简便，是目前最广泛使用的免疫组织化学方法。

2．链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶联结法（streptavidin－perosidase，SP）　在ABC法基础上进行了改进，即用辣根过氧化物酶直接标记链霉卵白素，用生物素标记二抗，形成一抗－生物素化二抗－HRP标记的链霉卵白素复合物。与ABC法相比，SP法过氧化物酶直接与链霉卵白素相连，在原卵白素－生物素－过氧化物酶复合物中没有了生物素的中介连接，尤其是链霉卵白素不与某些组织中内源性生物素结合，减少了背景着色，扩大了使用范围。目前SP法比ABC法应用更加普遍。

【染色步骤】

1．ABC法

（1）切片脱蜡、梯度下降乙醇至水。

（2）PBS洗3次，每次5min。

（3）0．3%H2O2，37℃，10min，置湿盒中。

（4）PBS洗3次，每次5min。

（5）枸橼酸缓冲液（pH　6．0）中煮沸（100℃，1min），自来水冲洗容器冷却。

（6）PBS洗3次，每次5min。

（7）正常山羊血清封闭，室温20min，甩掉多余的血清，不洗。

（8）滴加适当稀释的一抗，4℃过夜或者37℃，1h，湿盒中。

（9）PBS洗3次，每次5min。

（10）滴加生物素化二抗，37℃，1h，湿盒中。

（11）PBS洗3次，每次5min。

（12）加卵白素（A液）－生物素过氧化物酶（B液）复合物，A∶B为1∶1，稀释50倍，37℃，1h，湿盒中。

（13）PBS洗3次，每次5min。

（14）0．05%DAB－0．01%H2O2（0．05mol／L的TBS配制），室温显色10～20min，显微镜下掌握染色程度。

（15）自来水洗终止反应。

（16）常规脱水、透明、封片。

2．SP法

（1）切片脱蜡、水化。

（2）PBS洗3次，每次5min。

（3）0．3%H2O2，37℃，10min，置湿盒中。

（4）PBS洗3次，每次5min。

（5）枸橼酸缓冲液（pH　6．0）中煮沸（100℃，1min），自来水冲洗容器冷却。

（6）PBS洗3次，每次5min。

（7）正常山羊血清封闭，室温20min。

（8）滴加一抗，4℃过夜或者37℃，1h。

（9）PBS洗3次，每次5min。

（10）滴加生物素化二抗，37℃，1h。

（11）PBS洗3次，每次5min。

（12）滴加链霉卵白素－过氧化物酶复合物，稀释1∶50，37℃，1h，湿盒中。

（13）DAB显色同ABC法。

（14）自来水冲洗终止反应，常规脱水、透明、封片。

★EnvisionTMSystem

本法是近几年在国内推广使用的二步法免疫组化检测方法。

【基本原理】　将多个抗鼠或抗兔IgG分子（二抗）与辣根过氧化物酶共同聚合在1个氨基酸骨架上，形成多聚体复合物，再与抗原抗体复合物中的第一抗体结合，经DAB显色即可完成染色。

【主要特点】　敏感、省时、方便、背景低。因不使用生物素分子，所以避免了内源性生物素造成的非特异性背景着色。目前市面上见到的是PV二步法试剂盒，其中PV－6001试剂盒为羊抗兔IgG多聚体（即二抗来自山羊，一抗必须购买来自兔的）；PV－6002试剂盒为羊抗小鼠IgG多聚体（即二抗来自羊，购买一抗时必须是来自小鼠的）。

【染色步骤】

（1）切片准备同前。

（2）加第一抗体、孵育、漂洗。

（3）加二抗－过氧化物酶聚合物，孵育、漂洗。

（4）DAB－H2O2显色反应同前；常规脱水、透明、封片。

★真空负压LSAB（labeledstreptavidinbiotin）法

本法创立于1992年，其基本原理是各种物质的分子在真空负压的条件下，由于失重而飘游起来，从而增加了各物质分子间的碰撞机会，加速了抗原抗体的结合，使反应提前完成。实验证明，该法能够提高染色效果，节省染色时间。