一、酶联免疫技术的原理和分类
1.酶联免疫技术（ELISA）的基本原理
最早的酶联免疫技术按以下的过程进行：
（1）将待测定的抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；
（2）加入能与结合抗原或抗体特异性结合的特异性抗体或抗原（这种结合的事先用酶连接成酶标抗体或或抗原，使得其既保留了与固相结合物特异性结合的免疫活性，又因为标记酶而具有酶的活性；
（3）充分洗涤未与固相载体结合后的游离酶标抗体或抗原，最后结合在固相载体上抗体或抗原量相同于结合的标记酶量；
（4）加入能为标记酶催化的底物，底物可由无色变为有色产物；
（5）产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅对待测抗原或抗体的量进行定性和定量分析。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
这是最早的酶联免疫方法，属于直接标记检测抗体或抗原。这种方法需要标记与固相载体结合抗原特异结合的抗体，由于标记操作繁琐而不易掌握，因此实际上操作的干扰很大，不易掌握。随着上世纪70年代酶联免疫吸附法的问世，目前已经对酶联免疫吸附法（ELISA）进行了大量的改进。变得各个实验室均极易掌握的一项实验技术。
2.酶联免疫技术（ELISA）的分类
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。早期的方法属于直接 ELISA法，即用酶直接标记参加反应的抗原或抗体，反应可一步完成，但灵敏性较差，且抗体标记技术不易掌握。间接ELISA只要标记一种共同的抗体，如采用鼠抗体检测病原，只要用酶标记兔抗鼠抗体即可获得稳定的结果，实验者只要制备抗病原的抗体，而酶标抗体可从相关公司购得稳定的酶标二级抗体，而且通过二级抗体的结合，还有提高检测的灵敏性。
目前常用的ELISA法简要介绍如下：
（1）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，过程为：将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合抗体；加含有等测抗原的标本，使其与固相抗体接触反应一段时间，让抗体、抗原充分结合形成固相抗原复合物，洗涤除去其他未结合物质；加酶标抗体，与固相免疫复合物抗原结合，该抗体已经酶标记结合；加底物显色，有色产物的数量与抗原的结合量有关。
同样原理，也可将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，可有于检测标本中的特异性抗体量。
（2）间接法测抗体
间接法是检测抗体最常用方法，其原理为利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法，步骤为：特异性抗原与固相载体结合形成固相抗原→加稀释的待检血清，使其中特异抗体与抗原结合形成固相抗原抗体复合物→加酶标抗抗体，与固相复合物的抗体结合→加入酶底物，检测固相载体上的酶量，可得知相关的特异性抗体量。
通过更换不同固相抗原，可检测动物对对抗原的抗体水平。
（3）竞争法
竞争法为受检抗原/酶标抗原竞争与固相抗体结合，或者是受检抗体/酶标抗体竞争与固相抗原结合的过程，前者用于测定抗原水平，后者用于测定抗体水平。操作步骤为(以抗原竞争法测抗原为例)：特异抗体与固相载体连接形成固相抗体→加入待检标本及一定量酶标抗原混合溶液，两者与固相抗体竞争结合；加底物显色，如待抗原量大，则酶标抗原结合减少，颜色较浅，两者成反比，可计算出待检抗原的浓度或滴度。
（4）生物素-亲和素ELISA
生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，化学方法制成的生物素衍生物（生物素－羟基琥珀亚胺酯）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化产物；亲和素是一种糖蛋白，存在于蛋清和链霉菌中，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的链霉和素（strepavidin）。用生物素标记抗体，再采用酶标记的亲和素与其结合，由于亲和素与生物素的结合特异性强、亲和力大，两者一经结合就极为稳定，并可形成一种类晶格复合体，可大大提高ELISA敏感度。
亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号，即桥联法ABC-ELISA夹心法测抗原。
二、ELISA检测技术的试剂和耗材简介
ELISA 检测技术整个过程包括固相载体、抗原/抗体、免疫吸附剂、酶和底物等，现简要介绍如下。
1.固相载体
最常用的是聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质性能，且价格低廉，普遍用于ELISA试验中。常用的ELISA载体是微量反应板，也有聚苯乙烯小试管和小珠，小试管可作为反应容器直接经分光光度计中比色；小珠为直径0.6cm圆球，可用于圆珠滚动淋洗。最常用的为微量反应板，又标酶标板或ELISA板，国际通用为8×12的96孔板，目前使用较多的是8联或12联孔条可拆式，使用方便。
2.抗原和抗体
在ELISA实施过程中，抗原和抗体的质量是实验是否成功的关键,一般要求抗原纯度高、抗体效价高、亲和力强。抗体分多克隆抗体和单克隆抗体两类，以单克隆抗体为好，多用小鼠腹水单抗。
3.免疫吸附剂
固相抗原或抗体称为免疫吸附剂，抗原或抗体固相化的过程称为包被。包被一般为抗原或抗体溶解于的p H9.6的碳酸缓冲液，在ELISA板上4℃结合过夜，清洗后即可应用。包被结束后，固相载体表面未被覆盖的结合位需加入其他蛋白质与以吸附，这个过程称为封闭。常用的封闭为1％～5％牛血清白蛋白。
4.酶和底物
ELISA中常用的酶有辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），其中辣根过氧化酶底物有邻苯二胺、四甲基联苯胺；碱性磷酸酶常用底物为对硝基苯磷酸酯和。通常碱性磷酸酶的敏感性高于辣根过氧化酶。
三、ELISA检测技术示例
罗氏沼虾野田村病毒TAS-ELISA诊断试剂盒的应用
罗氏沼虾肌肉白浊病是近年来新出现的疾病，又称白体病、白尾病等，主要危害罗氏沼虾苗种，发生于虾苗淡化后至放养到池塘3-5周内，表现为肌肉出现白斑或呈白浊状，病虾可在较短时间内大量死亡。引起罗氏沼虾肌肉白浊病的病原为罗氏沼虾野田村病毒（原译作诺达病毒），病毒大小为23～25纳米，传染性极强，目前该病尚缺乏有效的控制办法。
该试剂盒提供了TAS－ELISA检测罗氏沼虾野田村病毒的方法，TAS－ELISA全称三抗体夹心酶联免疫测定法。诊断试剂盒提供了酶标板、病毒阳性对照、病毒阴性对照、小鼠抗病毒单克隆抗体、酶标抗体、显色液A等。实验步骤如下：
（1）取待测的虾苗1～2尾于EP管中，加入300微升磷酸缓冲液（PBS），充分研磨，离心取上清；
（2）吸取100微升上清液加入用抗体预包被酶标板，同时设阳性对照、阴性对照及空白对照孔，37℃孵育60分钟，用PBS冲洗、拍干，重复3次；
（3）各反应孔中加入小鼠单克隆抗体100微升，37℃孵育60分钟，冲洗同上；
（4）加酶标抗小鼠抗体，37℃孵育60分钟，冲洗同上；
（5）加入显色液（TMB或OPD）100微升，暗处显色10～15分钟；
（6）各反应孔中加入2 M H2SO4100微升，终止反应。
反应终止后，阳性对照显黄色、阴性对照不显色、样品如显黄色可判定为野田村病毒感染，如阳性对照未显示黄色或阴性对照显示黄色，则检测过程有问题，应重做检测。
图15 TAS-ELISA诊断试剂盒实验过程示意图
习题：
1.真菌的致病性？
2.水霉病的病原、病症、诊断方法和预防措施？
3.镰刀菌病的病症和诊断方法？
4.对虾卵和幼体真菌病的病症和诊断方法？
5.病毒的形态结构和增殖方式？
6.病毒的致病机理？
7.草鱼出血病的病症、流行情况、诊断方法和预防措施？
8.传染性胰腺坏死病的病症和诊断方法
9.斑点叉尾鮰病毒病的病原、病症、流行情况和诊断方法？
10.传染性造血器官坏死病的病原、病症、流行情况和诊断方法？
11.病毒性出血性败血症的病原、病症、流行情况和诊断方法？
12.鲤春病毒血症的病原、病症、流行情况和诊断方法？
13.对虾白斑症病毒病病症、流行情况、诊断方法和预防措施？
14.桃拉综合症病毒病病症、流行情况、诊断方法和预防措施？
15.黄头病的病症、流行情况、诊断方法和预防措施？
16.斑节对虾杆状病毒病的病原、病症、流行情况和诊断方法？
17.河蟹颤抖病的病原、病症、流行情况和诊断方法？
18.罗氏沼虾白尾病的病原、病症、流行情况和诊断方法？
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