原子吸收分析方法手册

（一）六种微量元素检测的方法特点

人体内微量元素的含量通常是百万分之几（ppm）或十亿分之几（ppb）。测定这些极微量的元素，要求有非常精密的测试仪器及正确的方法，否则在测试过程中极易损失或被污染，失去生物标本的原貌。另一方面，微量元素虽然很少，但其生物学作用很大，监测数据是否准确，有无可比性，是十分重要的。因生物标本的组分及价态非常复杂，且易受其他组分的影响，而传统的标准物质或标准液只是一种简单的离子或化合物，其测得的回收率很难反应标本的回收率。

为了保证实验数据的准确性与可比性，WHO要求在人体生物监测中强调采用标准参考物质（Cettified Reference Material CRM）。CRM不仅可以校准测试仪器，评价测试方法，也可以用于检验实验室内部及实验室之间数据的准确性及可比性。另外，为了保证分析的质量，更强调对监测的全过程、各个环节（设计、选择样本、采样、保存及运输、采样前处理、分析测试、数据处理、技术人员培训及管理等）采取严密科学设计控制。

现在检测血铅的方法有许多种，从当前医疗行业检测微量元素应用的分析方法来看，在临床医学上广泛应用的方法主要为生化法、电化学分析法、分子光谱分析法、原子吸收光谱法这几种。下面简单介绍一下生化法、电化学分析法、分子光谱分析法、同位素稀释质谱法、原子荧光分光光度法及原子发射光谱分析法6种检验方法的主要特点，然后重点介绍原子吸收光谱分析法：

1.生化法的特点

（1）抽取静脉血，采血量较大。

（2）需要前处理，操作复杂，澄清血清耗时长。

（3）检测的血清受近期饮食结构、营养水平影响极大，从而使数据缺乏客观准确性。

（4）试剂成本较高。

（5）检测元素种类受限制。

2.电化学分析法的特点

（1）抗干扰能力较差。

（2）可以用于痕量的测量，但往往误差较大。

（3）测定多种元素时，重复性差。

（4）对环境污染严重。

电位溶出分析法是一种新兴的电化学分析方法，该方法将有效的富集手段和先进的测量技术结合在一起，具有极高的灵敏度，同时该方法还具有很强的抗干扰能力，能有效防止溶液中有机杂质等的干扰，在测定样品中铅等微量元素时，无须消化或只须简单处理即可测定，简便了操作程序。而目前主要采用两种极谱技术溶出，即线性扫描溶出法和微分电位溶出法（diffirential potential stripping analysis，DPSA）。DPSA的灵敏度比线性扫描溶出法高1～2个数量级，分辨率也很好。目前DPSA在国内实验室使用较广泛，其灵敏度和精确度可与AAS法接近，价格比AAS低廉，可用于基层血铅水平的筛查。

3.分子光谱分析法的特点

（1）灵敏度不高，抗干扰能力较差。

（2）精度不高，限于常量的分析和金属化合物的测定，不适用于进行痕量测定。

（3）预处理复杂，很难清除血液中的色素。

（4）操作繁琐，对人员要求较高。

4.同位素稀释质谱法（isotope dilutionmas spectro metry， IDMS）特点

（1）是血铅检测最经典、最精确、最可靠的方法。

（2）测定方法复杂、费时。

（3）仪器价格昂贵。

该方法并无临床实用价值，通常只在需要对某种新的血铅检测方法进行评价时，才用来作为经典的对照方法。

5.原子荧光分光光度法（atomic fluorescence spectrometry analysis，AFS），是一种通过测量待测元素的原子蒸气，在一定波长的辐射激发下发射出原子荧光，根据荧光发射的强度来测定待测元素含量的一种仪器分析方法。其具有灵敏度高、检出限要比原子吸收法低1～2个数量级、分析曲线线性较好、干扰效应相对较小、多元素分析能力优于原子吸收法等优点，但他受散射光影响较严重，在一定程度上影响了该法的普及和发展。

6.原子发射光谱分析（atomic emission spectrometry analysis，AES）也可用于血铅的测定，是根据组成物质的气态原子或离子受激发后产生的光谱而建立的分析方法。他具有以下几个优点：

（1）选择性好，分析时不受其他元素干扰。

（2）灵敏度高，绝对灵敏度一般可达10－9～10－8g，相对灵敏度可达10－7～10－5g。

（3）准确度较高，若被测成分的含量在0.1%～1%时，准确度接近化学分析法，若被测成分的含量低于0.1%时，采用一些新的光源，其准确度可与AAS接近。

（4）取样量少，分析快速。

（5）有局限性，对高含量元素分析准确度较差，需要有一套标准试样对照，实际操作不便。

（6）仪器价格仍较昂贵，推广使用受到了限制。

虽然上述的6种方法均可以在临床检测人体微量元素中应用，但由于其自身的种种弊端，这些方法已基本被更先进、更准确的原子吸收光谱分析法所取代。

（二）原子吸收光谱分析法

1.原子吸收法　原子吸收光谱分析法（atomic absorption specffoscopy，AAS）又被称为原子吸收分光光度法，通常简称原子吸收法，所谓原子吸收光谱法即是靠测定自由原子对辐射的吸收来定量的一种分析方法。原子吸收光谱分析使得人们对体液和组织中含量在ppb级的那些元素得以在医学上应用，人类可从微观上定量测定生物（特别是人）各个组织部分的微量元素的分布，从而推动了医学和生命科学的发展。

2.构成　一台现代的原子吸收光谱仪通常由以下几部分构成：

（1）光源。

（2）原子化器。

（3）分光系统。

（4）检测系统。

（5）计算机控制系统。

（6）显示和打印系统。

3.原理　目前国际上最常用的方法是原子吸收光谱法，他是根据处于气态的基态原子在特定波长光的辐射下，原子外层电子对光的特征吸收这一现象建立起来的一种光谱分析方法。吸收的总值取决于存在的自由原子数目和自由原子吸收辐射的程度，其基本原理为：从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长的入射光强加在原子化器中，投射到待测元素的基态原子蒸气中，对入射的特定波长的光产生吸收，而未被吸收的部分则透射过去。通过测定吸收特定波长的光量大小，求出待测元素的含量。具有选择性强、干扰较小、准确度较高、分析速度快和灵敏度高等优点。

4.分类　根据原子化的方法又可分为火焰原子化（flame atomization）和无火焰原子化（flameless atomization）等。

（1）火焰原子化器操作简便，重复性好，相对平均偏差可小于3%，测定灵敏度一般为10～6数量级。但由于原子化效率低，自由原子在吸收区域停留时间短（为10～3s），限定了测定灵敏度的提高。

（2）无火焰原子化器的种类很多，其中以石墨炉原子化器最具代表性，应用也最广泛。它的原子化效率高，几乎达100%；试样用量少，不受试样形态限制；能直接测定其共振吸收线位于真空紫外光谱区域的一些元素；由于操作几乎是在封闭系统内进行，故对有毒和放射性物质的分析比火焰法安全可靠，但它也受一些因素影响，例如背景吸收干扰等。现在一般采用氘灯背景校正法，这种方法是用一个连续光谱（氘灯）与锐线光源的谱线交替，通过原子化器并进入检测器，当氘灯发出的连续光谱通过时，因原子吸收而减弱的光强相对于总入射强度来说可以忽略不计。

目前，原子吸收分光光度计上一般都配有氘灯的自动扣除背景装置。现在还有一种常用的背景校正方法，就是塞曼效应背景校正法，其特点是能在190～900nm的波长范围内有效地扣除吸光度高达1.7的背景吸收，这种校正方法将一磁场加在光源或原子化器上进行调制，使共振发射线或吸收线分裂成偏振方向不同而波长相近的3个成分：π、σ＋和σ－，其中π成分波长不变可作为分析线，以σ±成分作为校正吸收线进行背景校正。因此与氘灯扣除背景相比，塞曼效应扣除背景的效率高，且不易引起背景过校正的误差。

（3）单通道与多通道原子吸收光谱分析　原子吸收光谱分析又分为单通道与多通道，大量实验结果表明同一方法（无论单通道还是五通道）测定同一对象静脉血和指血中5种元素含量的结果相近。改进的单通道法、五通道法测定指血与传统的消化法测定静脉血中5种元素含量的结果相近。以单通道法和五通道法测定指血中5种元素含量的结果相近。由此提示：检测人体血液中5种元素含量取少量指血，无需消化等反复处理，若以五通道法测定更具优越性，具体见表4－2。

表4－2　单通道光谱仪与多通道光谱仪仪器及测量方法对比

5.比较　单通道和多通道方法比较，多通道的方法更具有其自身的优越性。

（1）标准液及标准曲线的简化：传统消化法需配制Cu、Zn、Ca、Mg和Fe 5种元素各自不同浓度的标准液。改进法只需一个系列的标准液。测定时人机对话，以优化方法拟合曲线。单通道法分别做Cu、Zn、Ca、Mg、Fe 5条标准曲线，五通道法同时发射5种元素的特征谱线，一次进样即可做Cu、Zn、Ca、Mg、Fe 5条标准曲线。简化了操作步骤，加快了检测速度，减少了对环境的污染。

（2）标本量的减少及前处理的简化：改进法使取血量从500μl静脉血变为40μl指血。提高了受检查的可接受性。改进法省去了繁复的前处理环节（浓HNO3的消化、悬浮物的溶解、冷却和定容等），标本以细胞溶解液混匀后即可上机测定，大大简化了实验步骤，提高了检测速度，减少了对标本和环境的污染，降低了检测结果的离散性，提高了测定的准确性。使得此方面的科研和临检更易进行。

（3）测定计算的智能化：传统方法需调整仪器条件，逐个测定、人工计算各元素含量，工作量很大。改进法运用微机和专用检测软件对主机进行控制、调整仪器参数、计算和打印实验结果，减少了人为操作和计算有可能带来的错误，缩短了出报告所需时间，减少了测试者的工作量，其自动贮存数据有易于资料的统计分折。尤其五通道法一次进样即可同时测定出5种元素的含量，较单通道法更具有优越性。

多通道光谱仪测定Cu、Zn、Ca、Mg、Fe 5种元素含量的结果与传统方法测定的结果一致。其与单通道的测量技术相比具有易接受、简便、快速、准确、污染少等优越性。目前多通道的原子吸收光谱技术在国内外仍处在领先的地位。

6.氢化物发生原子吸收法　现在有些实验室采用氢化物发生原子吸收法。在一定的酸度条件下，某些元素可与还原性物质（如硼氢化钾等）作用而生成极易挥发的氢化物，这些氢化物经石英管导入火焰中或电加热环境中极易原子化。由于这种方法可以从较大量的溶液中分离出被测元素，因而其灵敏度要比常规的火焰原子吸收法高，干扰也小得多。此方法需要预处理，故操作比较复杂。

血铅检测的方法还有许多种，以上只介绍了一些较常用、较新的方法和技术。铅中毒已成为影响我国儿童生长发育的重要因素，其普遍性和严重性也日益引起了人们的重视。

虽然有许多实验室都开展了血铅检测的项目，大大促进了血铅检测技术的飞速发展。但是也还存在一些问题，例如，由于不同实验室采用不同的检测仪器和检测方法，其得到的血铅结果之间的可比性较差。血铅测定属微量分析范畴，任何细微的内、外界因素都可能影响其结果的可靠性，所以质量控制在血铅整个分析过程中更显得重要。

质量控制包括分析前的质量管理、分析时的质量管理及统计质量控制，现在一些实验室往往忽视了分析前的质量管理，而这又是分析过程中的质量控制手段所无法控制的。例如采血时要彻底清洁静脉穿刺部位的皮肤，使用无铅注射器、试管、抗凝剂等；采血后要充分混匀、完全抗凝等。总之，防止标本污染和血液凝集是关键。目前还需要建立一套完整的血铅检测系统，其中包括仪器、试剂、校准品、操作程序、质量控制、保养计划等各个方面，这样才能更好地为临床铅中毒的诊断和防治提供有力的支持。

（三）铅测定方法

铅经消化道和呼吸道进入血液，然后随血液到全身，主要分布于骨骼、软组织中，部分随尿排出。因此血液、尿液、骨骼、牙齿和头发等组织中的铅都有可能不同程度地反映体内的铅负荷水平。儿童铅中毒的诊断不是依据临床上有无中毒表现，而是根据体内有无中毒量的铅水平，即完全依据体内血铅负荷来决定。一般采用原子吸收光谱法（AAS）测定其含量，血铅≥0.483μmol/L（10μg/dl）者即为铅中毒。除此之外，还可通过检测发铅、骨铅、齿铅等来判定铅中毒。

1.常用的铅测定方法

（1）双硫腙络合比色法：广泛应用于测试其他方法的准确性。样品为10ml血、25ml尿或组织颗粒等，通过酸氧化而灰化，以去除有机物。灰化之后，试样再重新溶解于酸化水中，随后将pH调整到9～10，再加氰化物以除其他金属离子的干扰，最后样品与双硫腙作用生成双硫腙铅－红色络合物。此络合物被氯仿萃取，可用分光光度法于波长510nm处测量。

（2）原子吸收光谱法（ASS）：原子吸收光谱法是一种常规的元素分析法，可以用来分析常规样品中铅含量。它是基于铅所产生的原子蒸气对特征谱线的吸收作用来进行定量分析。首先将试液喷射成雾状进入燃烧火焰中，含铅盐的雾滴在火焰温度下挥发并离解成铅原子蒸气，用铅空心阴极灯作光源，它辐射出波长283.3nm的铅特征谱线的光，当光通过一定厚度的铅原子蒸气时，部分光被蒸气中基态的原子吸收而减弱。通过单色器和检测器测得铅特征谱线被减弱的程度，即可求得试样中铅的含量。

用火焰原子吸收法做人体血铅含量分析，无论是采用甲基异丁酮萃取血铅还是用螯合剂都是一种陈旧的技术。由于对人体产生影响的血铅是微量的，再加上铅是易挥发且电离电位较低的元素，所以使用火焰原子吸收光谱，铅的原子化率是非常低的，即它的灵敏度是达不到检测人体血铅的检测范围；同时由于在处理血样的过程是完全暴露在环境（如灰尘）中，血样进行硝化处理时使用国产硝酸，这种硝酸的铅含量过高就可能造成对血样的二次污染，从而造成儿童实际血铅水平较低而测量结果较高的现象，即假阳性现象。

血铅测定样品的前处理有以下几个特点：

①样品的消化或处理的目的是使铅从样品基体中分离出来。

②铅离子经吸入火焰或经电热作用被还原成原子态。

③以铅的特征共振频率（283.3nm）的光吸收来进行分光光度定量。常用铅吸收峰的高度或峰面积来计算铅浓度。

④经典的ASS法有与双硫腙比色法类似的用酸氧化灰化过程。在样品处理后，离子铅溶液被吸入空气－乙炔火焰，在这里，铅离子被还原成原子状态，通过测定铅在波长283.3nm的光吸收强度来定量。

（3）电热的ASS法：又叫石墨炉和碳棒技术，石墨炉原子吸收光谱测定法已被有效的用来测定血液中铅含量。现代的原子炉测定仪器是可靠、准确、高精度和全自动的。这类仪器要有塞曼效应背景修正系统，并保证用于分析铅的波长稳定在283.3nm。使用石墨炉原子吸收光谱可以大大提高铅的原子化效率，使灵敏度大幅度增加而达到检测血铅的检测范围。但石墨炉原子吸收光谱受光散射和分子吸收的影响比火焰原子吸收量大，因此有必要对石墨炉原子吸收光谱进行背景校正，一般选择塞曼效应校正背景。

电热ASS法程序是将石墨管或炭棒放置在ASS光轴上，这个管用氮与大气隔开，在注入样品后，用电阻把石墨或碳棒连续加热达100℃干燥温度，400℃的灰化温度，然后升到2 000～2 500℃原子化温度（这是还原反应），这时光路中形成一个高浓度的Pb，这些原子通过扩散而迅速逸散。仪器输出铅在波长280.2nm和283.3nm的光的吸收信号（一种在几秒钟之间的瞬间信号），同时以此做出定量。

在使用塞曼效应石墨炉原子吸收光谱来测定血铅时，要注意以下几个方面的问题：

①在采血后对血样进行硝化处理过程中，由于此过程血样是完全暴露在环境（如灰尘）中，因此一定注意防止环境中的铅污染血样。

②在采血后对血样进行硝化，硝化的作用是去除血液里的纤维素，使铅以游离态的形式存在于溶液中，处理过程中有时使用的国产硝酸本身铅含量就很高，甚至会高于血样的铅含量，因此有必要在对血样进行硝化处理前先检测硝酸的铅含量，并采取措施降低硝酸的铅的含量，避免血样的二次污染。

③在使用塞曼效应石墨炉原子吸收光谱来测定血铅时必须要有专业技术人员来完成此操作过程。

（4）阳极溶出伏安法（ASV）：溶出伏安法是测量各种间质中多种金属的一种电化学分析方法，它被用来测定血铅的浓度已有25年的历史。虽然此技术比较直接，而且仪器价格低，仪器体积很小，设备占用的空间也小，并且也不要求别的特殊辅助设备，但此方法所要使用的每个试剂的价格都比石墨炉原子吸收法所用的试剂价格高。

这种分析方法的原理是要求铅必须从其复合物中分离出来，并且以游离态Pb2＋存在，在镀汞的石墨电极上加负的电势使游离Pb2＋被电镀在镀汞的石墨碳电极表层。在达到一个特定的电压值时铅离子又会从电极上溶出，在此过程中将产生一定的电流，而此电流值正好与血样中铅浓度的大小成比例。

在阳极溶出伏安法（ASV）中，血样或尿样中的铅离子，首先被加有负电位的工作汞还原成元素铅，还原的铅则沉淀在汞电极上。Pb2＋＋2e→Pb0（沉淀在汞电极上），在预选时间以后，工作电极电位更加向正值移动，因此，引起来自汞电极的铅再氧化，氧化引起正电流，此电流强度与铅的浓度成正比并被测量。

Pb0（汞电极）→Pb2＋＋2e

ASV技术已成为一种可靠的和重现性好的用于微量血样的方法。环境科学协会（ESA）设计使用一种高效的汞－石墨复合电极，这种电极被ESA装在铅的半自动分析仪器中，来测定在汞－石墨电极上溶出铅时产生的电流，这时的电流变化被绘在记录仪上。通常用峰面积来计算浓度，而峰高同样是可以应用的。血ASV法作为常规分析已用于儿童铅接触、职业性工人铅接触以及铅中毒人群治疗期间生物样品的监测和研究中。

2.铅测定方法选择　各实验室选择哪种测定铅的方法，要根据以下几种因素：设备的可获得性；每天分析样品的数量；分析的目的和要求；工作人员的经验等基本背景情况。

NIOSH所推荐的测定铅的常用方法以及各种方法的精密度和准确性报告如下：

（1）血和尿铅的双硫腙比色法，准确性是97%±2%，变异系数为6%；

（2）用于血铅的阳极溶出伏安法（ASV），在100μl样品测定标准差为2ng（这是由试剂空白散射所引起的），100μl血样测定铅60ng时的分析误差是5%。尿铅ASV法，1ml样品测定标准差是2ng，1ml尿样测定（尿铅的水平为200ng时）总的分析误差大约是10%；

（3）石墨炉/ASS用于空气或血铅测定，变异系数为5.7%；血、尿铅的萃取/ASS法，血铅准确度为0.99μg±0.64μg/g，相对标准差为6.4%。原子吸收法已被美国临床化学协会选用。相对回收率可以表示测定的准确性，血铅相对回收率为98.8%± 1.0%，尿铅的相对回收率为99%±4.5%，发铅的相对回收率为97%±3.6%。

建议采用的组织铅分析方法的比较见表4－3，4－4。

表4－3　组织铅分析方法比较

表4－4　铅测定条件的比较

（续　表）

3.常用铅测定法的优、缺点

（1）双硫腙比色测定血和尿中铅的方法的主要干扰来自锡（Ⅱ）、铋和铊。

这一方法的缺点是：①大量的玻璃仪器需彻底清洗。②需要大量的试剂。③在操作过程中很容易发生外源性污染。④方法麻烦和费时，还要求分析人员有较高水平的熟练技术。

其优点为：①要求简单和比较便宜的设备。②铅的吸收率线性好，范围宽。③它不仅可满足小样品而且大量样品亦能适用。④干扰能迅速去除。

（2）原子吸收光谱法（AAS）　AAS法的主要优点是灵敏度比火焰AAS法高1～2数量级。其主要缺点：①样品基体影响比火焰AAS法更明显，要求使用标准加入法。②分格费时。③和火焰AAS法比，设备昂贵。

Delves杯法的优点：①样品量小。②快速。③只要求最低的技术水平。

缺点为：①来自本底吸收和基体效应的干扰。②每批杯的质量有变化，这样就要求对每个杯子都仔细使用质控。

（3）阳极溶出伏安法（ASV）　除了高灵敏度和线性范围广以外，从仪器的价格和分析时间来计算都比其他方法便宜。主要缺点是铊的干扰，这是由于铊和铅在相应的浓度下，铊的电流—电压峰不能从铅峰中分离出来。用于铅的ASV法灵敏度受试剂空白的绝对值的限制，通常为6±2ng。

基于美国CDC最佳试验方法的评定结果，血铅分析方法的类型用准确性和精密度按顺序排列如下：ASV＞Delves杯/AAS＞萃取/AAS＞电热炉/AAS。综上所述，ASV法是可用于血和尿铅常规测定的最佳方法。

在铅分析中产生测定误差的主要来源是，分析人员的实验能力和技术熟练程度以及外来因素的干扰。例如，双硫腙法是一种费力费时，完全由人工操作的方法，并操作程序繁多；而另2种方法，对血液毛细采样管的类型和使用要求严格，须密切注意防止污染。使用无铅血液采样管可克服采样窗口容器污染问题，自动吸收量稀释装置能大大地增加电热AAS测定方法的精密度。从准确性来说，铅测定值偏高可能是由于玻璃器皿，试剂或仪器的污染和不合适的空白校正所致。测定值低则可能由于在萃取或浓缩步骤中回收不完全和标准曲线的非线性范围所致。

另一个问题是在样品储存中铅的丢失，Meranger等人曾报告说铅不仅被玻璃或塑料容器吸附而丢失，储存时间延长和温度增高也会引起铅相当大的丢失，在一星期内可高达80%。在样品中加1%硝酸或3%过氧化氢可将保存时间延至5天，丢失减少到最小程度。在CDC血铅配伍试验方案中，用1.5mg EDTA/ml血并在－20℃下储存，已被证明这样做可防止铅的丢失，甚至可储存几个月。