实验二十七 微生物基因（GFP）的定点突变
一、实验目的
（1）了解基因定点突变在基因功能研究和微生物育种中的应用。
（2）掌握微生物基因定点突变的原理和操作方法。
二、实验原理
绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水蛭和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。它的相对分子量为30×103 kDd，受395nm近紫外光或470nm蓝光激发后，在Ca2＋催化下，能发出波长为510nm的绿色荧光。GFP基因来源于水母，表达绿色荧光蛋白，检测时不需要外源底物或辅助因子，且具有可以活体观察、灵敏度高、无毒害、结构稳定、作用持久等优点，可用以检测基因表达和在活细胞里定位蛋白质，实现在体内实时检测标记菌株的研究。
定点突变是指通过聚合酶链反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需的突变（通常是有利表型方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效地提高DNA所表达的目的蛋白的性状，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
定点突变一般要求含有待突变基因的高纯度质粒，不少于10μg，电泳图清晰，达到酶切与测序要求。定点突变的一般步骤如下：
（1）对待突变基因测序结果进行分析，设计突变方案。
（2）根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA序列两端引物，进行高保真PCR反应（图27－1）。
（3）将PCR产物克隆至T载体，或者根据要求亚克隆至目的载体；DNA测序验证突变序列的正确性。
GFP由238个氨基酸残基组成，其中65—67位残基（Ser65－Tyr66－Gly67）可自发形成荧光发色基因（对羟基苯并咪唑啉硐）。本实验通过定点突变将GFP的Tyr66转变成His66（Y66H），从而使GFP可以显示蓝色荧光。
图27－1 Quickchange基因定点突变示意
三、实验材料
（一）菌株与质粒
（1）大肠杆菌（E．coli）DH5α。
（2）质粒pET－GFP、pMD－18T等。
（二）试剂
（1）1 000×氨苄青霉素（Ampicillin）：100mg／mL氨苄青霉素钠盐溶于去离子水，后过滤除菌，并分装保存于－20℃冰箱。
（2）LB培养基：酵母浸出粉0．5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，琼脂1．5%，调pH 7．2。灭菌后，等琼脂培养基冷却到60℃，加入1mL 1 000×Ampicillin，后倒平板。
（3）SOC培养基：胰蛋白胨2%，酵母浸出粉0．5%，NaCl 0．05%，2．5mmol／L KCl，10mmol／L MgSO4，20mmol／L葡萄糖。葡萄糖单独配制，过滤除菌，用前按量（每20mL溶液1mg葡萄糖）加入培养基中。用10MNaOH调节pH至7．0。
（三）寡聚核苷酸引物
（1）用于Y145F突变的引物：
GFP＿Y145F－F：CACAAGCTGGAGTACAACTTCAACAGCCACAACGTC；
GFP＿Y145F－R：GACGTTGTGGCTGTTGAAGTTGTACTCCAGCTTGTG。
（2）用于Y66H突变的引物：
GFP＿Y66H－F：GTGACCACCCTGACCCACGGCGTGCAGTGCTTC；
GFP＿Y66H－R：GAAGCACTGCACGCCGTGGGTCAGGGTGGTCAC。
（四）工具酶
DNA限制酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、RNaseA等。
（五）其他试剂
琼脂糖、IPTG、X－gal、SDS、TEMED、Tris、dNTP、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、低熔点琼脂、分子量标志物（2kb Ladder）等。
（六）仪器设备
恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像仪、冷冻离心机、超低温冰箱、精密酸度计等。
四、实验内容
（一）GFP定点突变（第1天）
（1）将0．2mL管置于冰上，根据下表配制PCR主混液。所有不是酶的试剂需在室温下溶解，酶需在用时临时从冰箱中取出。主混液在振荡器上混匀，并离心机上短时间离心使液体沉于管底。
表27－1 PCR主混液（46μL for a final of 50μL）
（2）用移液器转移23μL主混液到另一个0．2mL PCR管。
（3）在一个PCR管中各加入2μL正向引物（Y66H－F，5μM），在另一个PCR管中加入2μL反向引物（Y66H－R，5μM）。
（4）将两个样品置于PCR仪进行PCR反应。PCR反应程序如下：
每一步PCR（循环数：3）
（5）再混合两个PCR管，振荡混匀，后分成两管（2×25μL）再PCR。
每二步PCR（循环数：20）
（6）PCR产物电泳观察。
配制0．8%Agarose－gel：混合5μL染料（Gel Red）与50mL 1×TAE电泳缓冲液。
上样：DNA Ladder。
混合10μL PCR产物与2μL含染料上样Buffer。
混合5μL空质粒与2μL含染料上样Buffer。
电泳条件：电压90V，时间30min。
在紫外灯下观察电泳结果。
（7）DpnⅠ酶解
在PCR产物（50μL）中加入1μL DpnⅠ，并37℃水浴过夜。
（二）突变体克隆与转化（第2天）
（1）将低温保存的分装好的E．coli DH5α（100μL）融化备用。
（2）水浴锅温度设为42℃。
（3）加4μL（10～50ng）PCR产物（p－eGFP Y145F＋Y66F）到100μL E．coli DH5α。
（4）再加入2μL空载体（pET－GFP）。
（5）将混合物管放在冰上放置15min。
（6）后将管置于水浴中40sec。
（7）将管放在冰中2min。
（8）在每个混合物中加入0．9mL SOC培养基，并37℃水浴60min，并250r／min振荡。
（9）离心（16 000g）1min，去除800μL上清液，后合剩下的200μL重新悬浮。
（10）将此200μL涂布于LB－Amp平板，并置于37℃过夜。
五、实验结果记录
通过UV灯检测LB抗性平板上生长的菌落。蓝色的克隆代表定点突变（Y66H）在eGFP－Y145F是成功的。绿色克隆代表PCR所用的模板DNA还没有被酶DpnⅠ完全消化。拍照记录转化菌株的荧光照片。
图27－2 突变克隆的观察
六、思考题
（1）基因定点突变的方法有哪些？它们的原理分别是什么？
（2）限制性内切酶DpnⅠ酶切回收DNA片段的作用是什么？
（3）如何判断定点突变是否成功？
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