物理诱变构建链霉菌高产突变库

实验二十三　物理诱变构建链霉菌高产突变库

一、实验目的

（1）学习和掌握紫外诱变育种的方法及测定诱变剂最适剂量的方法。

（2）了解60Co－γ辐照诱变的原理和方法。

（3）掌握琼脂块法筛选突变株的方法。

二、实验原理

辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程，如DNA合成的中止、各种酶活性的改变等，使各部分结构进一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变，而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞，经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官，即可产生生物体的遗传变异。

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20～30cm，照射时间依菌种而异，一般为1～3min，死亡率控制在50%～80%为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。

60Co－γ辐照诱变，一般将菌种的单孢子悬液置于不同剂量的60 Co－γ射线当中，照射适当的时间，将处理液适当的稀释，涂布于抗性平板上，进行有目的的筛选。

在产量性状诱变育种中，诱变处理后的微生物群体中，将会出现各种突变类型的个体，但其中绝大多数个体是负向突变。要将其中极少数的产量提高较为显著的正向突变个体筛选出来确实是比较困难的。为了花最少时间、最少的工作量取得最大的成效，就要设计和采用效率较高的筛选方案和适宜的筛选方法。琼脂块法是筛选菌株工作中一种基本而又重要的方法。它是通过对诱变之后抗性平板上长出来的若干单菌落进行打孔，培养，然后在检测平板上所形成的抑菌圈大小初步筛选菌株。这种方法可为之后的筛选工作减少压力，提高筛选的效率，减少筛选的盲目性。

三、实验材料及仪器

（一）出发菌株

出发菌种：链霉菌（Streptomyces fungicidious）。

检定菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC6633。

（二）培养基

（1）链霉菌活化培养基：可溶性淀粉2%，NaCl 0．05%，KNO30．1%，K2HPO4· 3H2O 0．05%，MgSO4·7H2O 0．05%，FeSO4·7H2O 0．000 1%，琼脂2%，pH 7．4～7．6。

（2）培养基Ⅰ：蛋白胨1%，牛肉浸出粉0．5%，NaCl 0．25%，琼脂1．5%，pH 6．4～6．6。

（3）培养基Ⅱ：蛋白胨0．5%，牛肉浸出粉0．5%，NaCl 0．8%，Na2HPO4 0．2%，琼脂1．5%，pH 7．9～8．1。

（4）种子培养基：玉米浆3．5%，可溶性淀粉3．0%，玉米蛋白粉0．5%，CaCO3 2．0%，pH 7．0。

（5）发酵培养基：葡萄糖4．0%，玉米淀粉2．0%，玉米浆2．0%，玉米蛋白粉3．0%，NH4Cl 0．5%，NaCl 1．5%，CaCO31．5%，pH 7．0～7．2。葡萄糖与玉米淀粉单独灭菌，使用前与其他培养基成分混合。

（三）仪器

高速冷冻离心机、恒温调速回转式摇床、高压蒸汽灭菌锅、人工培养箱鼓风干燥箱等。

四、实验步骤

（1）单孢子悬液的制备：取单菌落的产恩拉霉素链霉菌的孢子在高氏Ⅰ号培养基上划线，于28℃培养7d。然后用15mL无菌生理盐水洗下孢子，倒入无菌三角瓶中，置于磁力搅拌器上，使孢子分散，用无菌脱脂棉过滤得到单孢子悬液。采用血球计数板法，调整单孢子悬浮液中孢子浓度为108个／mL。

（2）最小抑菌浓度实验：将制备的单孢子悬液用10倍稀释法，依次稀释10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7几个梯度，分别取200μL涂布于添加0．1%，0．2%，0．3%，0．4%，0．5%浓度的恩拉霉素的高氏Ⅰ号平板上，对照组平板不添加，置28℃培养7d。

（3）紫外诱变：取10mL单孢子悬液于培养皿中（带磁力搅拌棒），置于诱变箱磁力搅拌器上，开启紫外灯，预热20min后，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15，30，45，60，75，90s。取不同时间段诱变处理液1mL，做适当稀释，测定处理液中存活细胞浓度（每时间做3个稀释度，每1稀释度做3皿平行）。孢子悬浮液进行适当稀释后涂布于加有比最小抑菌浓度大3倍的恩拉霉素的高氏Ⅰ号平板上，并且同时涂布空白平板上，置28℃培养3d。

（4）60Coγ辐照诱变：取新鲜制备的菌株单孢子悬液，离心沉淀后重新悬浮于适量无菌水中，分装3管以300Gy、500Gy、700Gy的辐照剂量进行60 Coγ射线辐照。辐照完成之后将孢子悬浮液进行适当稀释后涂布于加有比最小抑菌浓度大3倍的恩拉霉素的高氏Ⅰ号平板上，并且同时涂布空白平板上，置28℃培养3d。

（5）致死率和突变率计算：

致死率（%）＝（未经诱变培养基中菌落总数－诱变培养基中菌落总数）／未经诱变培养基中菌落总数×100%

正突变率（%）＝诱变筛选具有活性产物的突变体总数／诱变筛选挑取的菌落总数×100%

负变异率（%）＝诱变筛选活性较对照菌株低的突变体总数／诱变筛选挑取的菌落总数×100%

（6）琼脂块初筛法：用灭过菌的8mm孔径的打孔器将已培养3d的单菌落打下，打下之后的琼脂块置于无菌的恒温恒湿小室中培养7d，放置于含有2%检定菌的琼脂平板上37℃培养16～18h，测定抑菌圈大小，如图23－1所示。以出发菌株为对照。

图23－1　琼脂块初筛示意

（7）摇瓶复筛：挑选出正突变菌株，摇瓶发酵，于28℃，220r／min条件下振荡培养11d，管碟法测抑菌圈直径大小。筛选出高产突变株，并做菌种保藏。

五、实验记录

（1）细胞存活率和回复突变率的结果填入下表：

表23－1　两种诱变对链霉菌存活率的影响

表23－2　细胞的回复突变率

（2）绘制细胞存活率和突变率曲线。

（3）两种诱变实验效价测定结果记录。

六、思考题

（1）诱变育种过程中要注意的关键问题是什么？

（2）涂布好的平板为什么要半小时以后倒置培养？

（3）你觉得实验过程中还需要注意哪些细节？

（4）除了本实验介绍的诱变育种方法，你还能想到哪些常用的诱变育种方法？

参考文献

［1］杜连祥．工业微生物学实验技术［M］．天津：天津科学技术出版社，1992．

［2］沈萍，陈向东．微生物学实验［M］．4版．北京：高等教育出版社，2007．

［3］彭珍荣．现代微生物学［M］．武汉：武汉大学出版社，1995．

［4］汪天虹．微生物分子育种原理与技术［M］．北京：化学工业出版社，2005．

［5］Lederberg J．Encyclopedia of Microbiology［M］．San Diego：Academic Press，Inc，2000．