链霉菌组合生物合成新化合物

实验二十五　链霉菌组合生物合成新化合物

一、实验目的

（1）掌握链霉菌接合转导等遗传操作的实验方法。

（2）了解组合生物合成新化合物的原理及其在微生物研究中的应用。

二、实验原理

链霉菌是一类特殊的原核微生物，属革兰氏阳性菌，其个体形态不同于大多数细菌，为分枝繁茂的菌丝体，菌丝无隔多核，主要以孢子进行繁殖。链霉菌的菌丝根据形态和功能不同，可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。除了复杂的形态分化外，链霉菌还具有产生多种次级代谢产物的能力，据统计，约有70%的天然抗生素是由链霉菌产生的。鉴于链霉菌所产抗生素的巨大经济价值，建立链霉菌的高效遗传操作体系非常重要，因为无论是链霉菌的次级代谢和形态分化的研究，还是利用代谢工程、组合生物合成生产新的化合物，都需要高效的遗传操作系统才能实现。目前链霉菌的遗传操作体系主要有3种：聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化法、接合转导法和电转化法。

组合生物合成是将不同化合物的生物合成基因重新组合后，形成新的生物合成途径，从而产生新的化合物，这是新药研究中的重要进展。目前许多具有生理活性的天然产物的生物合成途径已经研究清楚，利用组合生物合成技术通过改变聚酮合成酶的基因合成了一系列“非天然的”的聚酮类化合物库，以供进一步的活性筛选。如利用加利利链霉菌ATCC 31671产生2－羟基阿克拉菌酮（2－hydroxyaklavinone）。本实验将含有聚酮体酮基还原酶（polyketide ketoreductase，PKR）的质粒转入加利利链霉菌ATCC 31671，可以产生阿克拉菌酮（aklavinone）。

图25－1　PKR的催化功能

三、实验材料和试剂

（一）菌株

加利利链霉菌（S．galilaeus）ATCC31671，大肠杆菌ET12567（含转导辅助质粒pUZ8002），大肠杆菌－链霉菌穿梭质粒pIJ8630－PKR。

（二）培养基和试剂

（1）YMA固体培养基（用于加利利链霉菌斜面培养）：Malt extract 1%，Yeast extract 0．4%，葡萄糖0．4%，微量元素液0．2mL，琼脂粉1．5%，调pH 7．2。

（2）GPS培养基（加利利链霉菌发酵培养基）：葡萄糖2．25%，黄豆饼粉1%，NaCl 0．3%，CaCO30．3%，微量元素液2mL。

（3）2×YT培养基：蛋白胨1．6%，酵母抽提物1%，氯化钠0．5%。

（4）MSF固体培养基：黄豆饼粉2%，甘露醇2%，琼脂2%。

（5）硫链丝菌素（thiostrepton，Thio）：用二甲基亚砜配制成50mg／mL的母液，备用。临用前取100μL母液加到10mL无菌水中，混匀，形成白色乳浊液，此时的浓度为0．5mg／mL。

（6）其他试剂：萘啶酮酸、氯仿、甲醇、环己烷、乙酸乙酯。

（三）器材与仪器

离心机、GF254硅胶板、培养箱、Eppendorf管、微量移液器、无菌枪头、培养皿、三角瓶、接种针、移液管、玻璃刮铲、玻璃珠等。

四、实验步骤

（一）链霉菌接合转导

（1）将过夜培养的含有带转质粒pIJ8630－PKR的大肠杆菌ET12567／pUZ8002 以1∶100转接到10mL LB培养基中。

（2）37℃，200r／min培养4h，一直到OD600大约为0．4。

（3）收集菌体，4℃，5 000rpm离心3min，弃上清。

（4）加入约10mL预冷的LB培养基，按照步骤（3）漂洗两次。

（5）弃上清，重悬于1mL预冷的LB培养基中。

（6）从－80℃冰箱取出适量链霉菌孢子悬液，加入500μL 2×YT培养基，5 000rpm离心3min，弃上清，加入500μL 2×YT培养基，45℃温育10min。

（7）混合500μL大肠杆菌菌液和500μL孢子悬液。短暂离心后，涂于MSF ＋10mM MgCl2培养基上。

（8）30℃培养16～20h后，涂布合适的抗生素和萘啶酮酸，30℃继续培养。

（9）培养至长出菌落，进行计数。

（二）产物鉴定

（1）将长出的单菌落接种到含25g／mL硫链丝菌素的YMA斜面上，28℃培养6～7d。

（2）从YMA斜面上挖块接种到GPS培养基中，28℃振荡培养6d。

（3）发酵液用氯仿∶甲醇＝9∶1抽提，溶媒挥发浓缩后，将提取物溶于氯仿中。

（4）在GF254硅胶板上层析，溶媒系统为环己烷∶乙酸乙酯＝1∶1。

（5）层析完毕后，在365nm紫外灯下观察。

五、实验结果记录

（1）计算链霉菌接合转导效率。

（2）记录产物在层析板上的位置。

六、思考题

（1）本实验中影响链霉菌转导效率的关键因素有哪些？

（2）在设计基因组合生物合成时应考虑哪些因素？

参考文献

［1］文莹，李颖．现代微生物研究技术［M］．北京：中国农业大学出版社，2008．

［2］Kieser T，Bibb M J，Buttner M J，et al．Practical Streptomyces Genetics ［M］．Norwich：The John Innes Foundation，2000．