双链的构建

二、双链RNA的构建

双链RNA可先在体外构建，用脂质体转染细胞，但转化到细胞内的双链RNA半衰期短，效果差。先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，能够持续发挥阻断基因的作用。构建双链RNA表达载体时，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成。因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，它指导的转录就会终止，转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，合成的RNA的3′－末端无polyA。U6启动子能识别RNA多聚酶Ⅲ，促进RNA合成。Bluescript是构建双链RNA的良好表达载体。RNA多聚酶Ⅲ可识别U6启动子，从GFP的基因上选择一个21个核苷酸的片段（片段1），插入到Bluescript载体中，合成片段1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片段2。将片段2接到Bluescript载体中片段1的下游，将载体转移到细胞内后，转录出的RNA具有回文序列，会形成一个发夹样结构，从而得到了双链RNA（图13－5）。片段1后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止。而且转录出的具有发夹样结构的RNA，会在3′端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，有利于双链RNA诱发RNAi。RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1－RNA启动子。在H1－RNA启动子后面接上能形成发夹样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA。T7作为启动子合成dsRNA，将PCR产物用NotI酶切后自身连接，回收正向片段和反向片段连接形成的具有反向重复序列的片段，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了能表达dsRNA的载体。用此载体可在体外合成dsR－NA，也可转入细胞内合成dsRNA。在后一种情况下，还须将表达T7RNA多聚酶的载体共同转入细胞中，提供能识别T7启动子的RNA多聚酶。腺病毒是体内转基因的常用载体，用腺病毒做载体，在体内或体外表达dsRNA，均能成功地阻断基因表达。

图13－5　表达dsRNA载体的构建