双链模板的扩增

双链DNA模板包括核DNA、叶绿体和线粒体DNA以及cDNA，已克隆的DNA也属这类模板。

【试剂】　Taq缓冲液（10×），Tris－HCl（pH　8．4）100mmol／L，KCl　500mmol／L，MgCl2 15mmol／L，BSA或明胶（gelatine）1mg／ml，dATP　50mmol／L，dCTP　50mmol／L，dGTP 50mmol／L，dTTP　50mmol／L，以上溶液用NaOH中和至pH　7～8。

【实验步骤】

（1）在1个灭菌的标准0．2ml的新Eppendorff管中，依次加入以下溶液。

Taq缓冲液（10×）5μl，dNTP　5μl，引物1（10pmol／μl）2．5μl，引物2（10pmol／μl）2．5μl，模板DNA　1～10ng，然后加水补至总体积为49μl。

（2）将以上溶液混匀放置于PCR扩增仪的基座孔中。

（3）按下列顺序设置PCR循环参数，通常为：变性94℃30～40s，退火55℃1min，延伸72℃1．5～2min，循环次数为25～35次，应根据实际要求而选择。

循环结束时的保温参数为72℃10min，这样可保证扩增出来的目的片段都是全长。

（4）反应结束后，取1／10体积的反应液进行0．8%～2%的琼脂糖凝胶电泳，以分离开目的DNA。对于100bp或是更短的扩增产物，可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

PCR产物特异性差，是由于模板DNA的复杂度不同，PCR的结果会有些差异。如用核DNA作模板即可能产生多条带扩增。这时也可采用一些方法将非特异性产物减至最少。一般可提高退火温度，必要时退火温度升至65℃，引物延伸温度降至65℃，使三温度变化PCR变成两温度变化PCR。也可减少引物量，或者减少体系Taq　DNA聚合酶含量，还可减少退火和引物延伸的时间，以解决非特异性的扩增。此外，如果改变了Taq缓冲液中Mg2＋浓度（一般降低Mg2＋浓度），也可有助于提高PCR扩增的特异性。